發(fā)布時間：2019-07-20 17:32

【摘要】：背景：骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)在兒童和青少年人群中是最常見的惡性腫瘤之一。從1879年有學者首次報道OS至今,OS的治療始終是醫(yī)學界的一個難題。盡管醫(yī)學進步飛快,現(xiàn)在臨床上已有許多新化療藥物用于治療OS,但OS患者的生存率在過去幾十年來一直徘徊不前。自從美國總統(tǒng)奧巴馬批準美國國立衛(wèi)生研究院啟動精準醫(yī)學計劃,分子靶向治療已成為惡性腫瘤患者的新曙光。分子靶向治療即是針對腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等不同環(huán)節(jié)應用特異性地分子靶向藥物如特異性抗體、高選擇性抑制劑或高活性調(diào)節(jié)分子治療不同類型和不同階段的惡性腫瘤。這種治療方法能高效并選擇性地殺傷腫瘤細胞,而不良反應輕微。但迄今為止,還沒有可用于臨床治療OS患者的分子靶向藥物。因此,詳細闡明參與OS發(fā)生發(fā)展的相關信號分子機制、開發(fā)新的分子靶向藥物成為亟待解決的問題。眾所周知,和其他惡性腫瘤一樣,OS的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因和抑癌基因密切相關。目前在OS和其他腫瘤中,所有關鍵抑癌基因中研究最多、最透切的要屬p53和Rb基因。p53基因通過調(diào)控兩個下游基因控制腫瘤細胞的凋亡,它們是bax基因和puma基因。二者均位于細胞質(zhì),當腫瘤細胞接收到凋亡刺激信號時,即轉(zhuǎn)位到線粒體,導致細胞色素C釋放,啟動細胞凋亡程序。p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控的另外一個基因p21,其編碼產(chǎn)物是一種核蛋白,是細胞周期中的重要調(diào)節(jié)因子,可抑制細胞增殖,有研究證實其與OS進展密切相關。但是,p53基因發(fā)生缺失突變后,沒有抑癌功能；如果發(fā)生功能性突變,不但沒有抑癌功能,反而會促進腫瘤發(fā)生。在OS中,多達一半以上存在p53基因功能性突變,p53等位基因缺失突變發(fā)生率還要更高。p53基因容易發(fā)生突變或等位基因缺失而喪失抑癌功能,Rb基因在OS中的作用又還沒有定論。然而幸運的是,p53基因家族新成員p73基因,其編碼產(chǎn)物與p53蛋白結構和功能都非常相似,卻極少發(fā)生突變或缺失。研究表明p73基因過表達能激活含有p53基因元件所驅(qū)動的CAT報告基因的轉(zhuǎn)錄,并上調(diào)內(nèi)源性p21、puma、bax基因的表達。因此,p73是一個非常有潛力的OS靶向分子。但p73基因轉(zhuǎn)錄表達的蛋白有很多種變體,而其中具有抗癌轉(zhuǎn)錄活性的是TAp73。而我們課題組和其他學者研究都發(fā)現(xiàn),TAp73的轉(zhuǎn)錄活性和功能在不同的腫瘤中受到很多不同蛋白激酶的修飾調(diào)控,影響其抗腫瘤效果。因此,確定催化TAp73發(fā)生化學修飾的激酶是一個難點問題,也是一個關鍵問題。它們將是很有潛力的治療靶點�，F(xiàn)在,生物信息學在生物醫(yī)學領域的應用給科學研究者們開辟了廣闊的前景。另外,生物芯片更是生物信息學在生物學中的又一重要應用。生物芯片是一種高通量檢測載體,它可以根據(jù)研究目的進行設計,通過樣本與芯片雜交獲得圖像,加工成實驗數(shù)據(jù),并運用生物信息學方法對實驗數(shù)據(jù)進行可靠性分析,得到大量而準確的實驗結果。很多研究者通過生物信息庫和預測軟件成功預測很多的蛋白修飾過程,并最終通過分子生物學實驗驗證。因此,生物信息庫和相關預測軟件是非常好的研究工具,比如蛋白磷酸化預測軟件KinasePhos, Scansite, GPS等等。諾貝爾獎獲得者W. Gilbert曾經(jīng)指出,傳統(tǒng)生物醫(yī)學解決科學問題的方式是僅僅通過實驗研究：但現(xiàn)在,在人類基因組破譯后這種方式將會徹底改變,科學研究將借助生物信息學工具從理論推測出發(fā)指導實驗研究,然后在實驗中去驗證或追蹤這些理論假設而獲得更完整的信息。因此實驗研究不再盲目沒有方向,不再像是大海撈針。因此,利用生物信息學結合實驗研究,將在21世紀取得輝煌成果,也將會創(chuàng)造不可估量的經(jīng)濟和社會效益。本研究擬運用生物信息學工具進行數(shù)據(jù)分析并結合實驗研究,在OS細胞中篩選和驗證催化TAp73發(fā)生磷酸化修飾的蛋白靶激酶,探索目標靶激酶的生物學功能及其分子機制,初步觀察以此為OS分子靶向的治療效果。目的：觀察和了解OS細胞中抑癌基因TAp73及磷酸激酶的表達譜情況,運用生物信息技術總結分析TAp73蛋白活性特點,篩選催化TAp73蛋白發(fā)生磷酸化修飾的靶向激酶,進行功能研究和效果驗證,為OS分子靶向治療的研究開發(fā)新方法,開拓新思路；也為OS分子靶向治療的臨床應用探索新靶點,并提供理論和實驗依據(jù)。方法：1.數(shù)據(jù)分析磷酸化修飾位點對TAp73蛋白功能的調(diào)節(jié)規(guī)律。通過搜索生物信息數(shù)據(jù)庫中已報道過的TAp73蛋白磷酸化修飾的文獻數(shù)據(jù),分析歸納在不同環(huán)境下不同蛋白激酶對TAp73蛋白修飾位點和功能調(diào)節(jié)的特點、規(guī)律。為TAp73蛋白磷酸化后的功能分析提供依據(jù)。并采用最新版蛋白磷酸化修飾預測軟件Scansite 3.0分析預測已知所有激酶在TAp73蛋白上的潛在磷酸化修飾位點及適用條件。2. cDNA芯片篩選OS細胞中催化TAp73發(fā)生磷酸化的靶向激酶。采用體外培養(yǎng)的OS細胞提取細胞總RNA,采用NanoDrop ND-1000對RNA進行定量和質(zhì)量控制,采用變性瓊脂糖凝膠電泳對RNA的完整性進行評估。評估合格后使用ds-cDNA合成試劑盒,利用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)引物(100 pmol)將5μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA (ds-cDNA)。然后對ds-cDNA進行定量分析,再采用單色DNA標記試劑盒對ds-cDNA進行標記。而后取其中4μg標記的ds-cDNA,使用NimbleGen雜交體系在42℃條件下將熒光標記的ds-cDNA與涵蓋了45033個來自包括NCBI在內(nèi)的權威數(shù)據(jù)庫基因的Roche NimbleGen 12 x 135K人類基因表達譜芯片雜交16小時,其后使用相應洗脫液洗滌,最后對雜交芯片進行掃描。將掃描數(shù)據(jù)按照美國NimbleGen Systems基因表達分析方案進行分析和篩選最有潛力的靶激酶。最后,在體外培養(yǎng)的不同OS細胞系中進行實時逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈式反應(Quantitative Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)實驗驗證芯片篩選結果。3.軟件GPS 1.0分析PLK2催化TAp73磷酸化位點及其實驗驗證。將篩選出的最有潛力的目標靶激酶PLK2運用生物信息軟件GPS 1.0分析預測其在TAp73蛋白上的催化位點,并進行功能預測。為后續(xù)實驗提供方向和理論依據(jù)。免疫共沉淀實驗(co-immunoprecipitation, Co-IP)定性分析靶向激酶PLK2是否與TAp73發(fā)生物理交聯(lián),進而用磷酸化蛋白印跡(Western Blot,WB)實驗檢測PLK2是否催化內(nèi)源性TAp73發(fā)生磷酸化修飾。實驗分組包括：空白對照組、空白siRNA對照組、siPLK2處理組、空白siRNA+DNA損傷藥物(25 μg/ml,下同)處理組、PLK2抑制劑(5μg/ml,下同)+DNA損傷藥物處理組、siPLK2處理組+DNA損傷藥物處理組。另一方面,根據(jù)磷酸化位點軟件預測結果構建TAp73蛋白定點突變表達載體,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的OS細胞；同時構建靶向激酶PLK2表達載體,轉(zhuǎn)染OS細胞；將表達蛋白進行免疫提純后進行體外激酶實驗,再用磷酸化蛋白印跡實驗檢測異位表達的TAp73蛋白磷酸化修飾結果,確定PLK2在TAp73蛋白上的催化位點。4.PLK2對TAp73轉(zhuǎn)錄活性影響及其相互作用機制。在OS細胞中進行RT-qPCR和WB實驗檢測PLK2. TAp73及其下游相關轉(zhuǎn)錄基因p21、puma的表達以驗證PLK2對TAp73蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響;實驗分組包括：DMSO對照組、空白siRNA對照組、siPLK2組、PLK2抑制劑組、DNA損傷藥物組、目的基因表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白siRNA+DNA損傷藥物組、PLK2抑制劑+DNA損傷藥物組、siPLK2+DNA損傷藥物組、siPLK2+siTAp73+DNA損傷藥物組。另一方面,進行蛋白半衰期實驗和共聚焦免疫熒光實驗檢測TAp73與PLK2的相互影響,以期了解二者相互作用的機制；實驗分組包括對照組和處理組。5.PLK2與TAp73作用對OS細胞的生理影響及初步動物實驗研究。通過對PLK2或TAp73干預觀察PLK2通過TAp73對OS細胞生理影響；流式細胞儀(Flow Cytometer, FCM)檢測觀察PLK2對OS細胞周期進展的影響；CCK-8細胞增殖實驗觀察PLK2對OS細胞增殖的影響；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(Terminal Deoxynucletidyl Transferase dUTP Nick End Labeling, TUNEL)實驗觀察PLK2對OS細胞凋亡的影響；細胞劃痕實驗觀察PLK2對OS細胞侵襲力的影響。實驗分組包括：空白對照組、siRNA對照組、siPLK2處理組、PLK2抑制劑處理組、DNA損傷藥物處理組、siRNA+DNA損傷藥物處理組、PLK2抑制劑+DNA損傷藥物處理組、siPLK2+siTAp73+DNA損傷藥物處理組。構建OS的裸鼠實驗模型,觀察PLK2抑制劑對OS生長的影響和治療效果,對OS組織樣本進行HE染色和免疫組織化學染色,初步觀察PLK2抑制劑治療后OS的病理特點。共3個治療組實驗均采用自身配對設計：分別用DNA損傷藥物順鉑(CDDP,25μg/g體重)、CDDP+PLK2抑制劑(5μ g/g體重,下同)、和PLK2抑制劑干預治療TAp73wt或TAp73nullOS;每個治療組6只實驗鼠。在成功構建實驗模型后,測量干預前腫瘤長徑a(mm)和短徑b(mm),并于干預4周后再次測量腫瘤長徑a(mm)和短徑b(mm),采用公式V(mm3)=1/2ab2腫瘤體積,比較治療前后腫瘤體積大小變化；并進行病理活檢和免疫組織化學染色初步觀察治療后OS的細胞及分子病理特點,評估PLK2抑制劑的治療價值,以期為該靶向激酶的最終在臨床上應用提供實驗依據(jù)和方案指導。結果：1.數(shù)據(jù)分析磷酸化修飾位點對TAp73蛋白功能的調(diào)節(jié)規(guī)律。通過檢索三大常用英文生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫即Pubmed、Embase、Ovid數(shù)據(jù)庫和三大中文數(shù)據(jù)庫即萬方、維普、以及中國知網(wǎng)中已發(fā)表研究TAp73相應氨基殘基位點發(fā)生磷酸化修飾及其相應磷酸激酶的文獻,結合蛋白磷酸化生物信息庫PhophositePlus. com中的收錄結果,共發(fā)現(xiàn)TAp73蛋白上已知磷酸化位點共14個,對應磷酸激酶11個；其中磷酸化修飾位點位于TAp73反式激活域TA1、TA2共5個,位于TAp73非反式激活域共9個；在TAp73反式激活域的磷酸化修飾將下調(diào)TAp73的功能活性,而在TAp73非反式激活域的磷酸化修飾均顯示上調(diào)TAp73功能活性。接著,運用最新版的蛋白磷酸化預測軟件Scansite 3.0對TAp73蛋白進行分析,預測所有已知磷酸激酶在TAp73蛋白上潛在的修飾位點。按高度匹配預測結果顯示,共有18個潛在磷酸化修飾位點,3個激酶結合位點。18個潛在位點中有酸性激酶催化位點2個,堿性激酶催化位點7個,脯氨酸激酶催化位點2個,其他激酶催化位點7個。除酸性激酶催化位點位于TAp73反式激活域,其余位點分布無明顯規(guī)律。根據(jù)前述總結,酸性激酶的催化位點發(fā)生磷酸化修飾將下調(diào)TAp73功能活性。2. cDNA芯片篩選OS細胞中催化TAp73發(fā)生磷酸化的靶向激酶。Roche NimbleGen 12 x 135K人類基因表達譜芯片涵蓋了45033個來自NCBI權威數(shù)據(jù)庫的基因。將芯片掃描數(shù)據(jù)按照美國NimbleGen Systems基因表達分析方案進行數(shù)據(jù)質(zhì)量分析,獲得滿意結果。人類細胞中已發(fā)現(xiàn)磷酸激酶共434種,以標準化表達信號超過200的標準篩選,在OS細胞中有明確表達的269種,其中在細胞膜定位的38種,細胞質(zhì)定位的77種,細胞核內(nèi)定位的48種,細胞膜與細胞質(zhì)定位的24種,細胞核與細胞核質(zhì)定位的30種,細胞骨架定位的6種,線粒體定位的2種,高爾基體定位的2種,核糖體定位的2種,染色體定位的2種,中心體定位的1種,紡錘體定位的1種,不明確定位的36種。表達豐度最高的10種依次是Casein Kinase 1 (CK1)、Calmodulin 1 (CAML1)、 Casein Kinase 2 (CK2)、Calmodulin 2 (CAML2)、Cyclin-Dependent Kinase 8 (CDK8)、CDC-Like Kinase 3 (CLK3)、Polo-like Kinase 2 (PLK2)、MAP/Microtubule Affinity-Regulating Kinase 2 (MARK2)、Cyclin-Dependent Kinase 4 (CDK4)和Polo-like Kinase 1(PLK1),其中有4種酸性激酶為CK1、CK2、PLK1、PLK2。采用RT-qPCR進一步驗證了OS細胞內(nèi)10種核質(zhì)內(nèi)高表達的磷酸激酶的相對表達水平,與芯片篩選基本相符,并發(fā)現(xiàn)PLK2在OS細胞內(nèi)的高表達,且與p53基因狀態(tài)無關,提示PLK2是有潛力的靶向激酶。3. GPS 1.0軟件分析PLK2催化TAp73磷酸化位點及其實驗驗證。因其他學者和我們課題組先后證實在不同細胞中酸性激酶PLK1和CK2均可磷酸化修飾TAp73蛋白。我們運用polo-like Kinase激酶特異性磷酸化位點預測軟件GPS 10對TAp73蛋白序列進行分析預測PLK2的催化位點,按高度匹配結果顯示共4個磷酸化修飾位點,2個激酶結合位點。結合前述結果分析,提示位于TAp73反式激活域的T27和S48位點為PLK2最可能的潛在催化位點�；谏鲜錾镄畔W數(shù)據(jù)分析,我們假設在OS細胞中,PLK2催化TAp73蛋白上反式激活域內(nèi)的T27或S48氨基酸殘基發(fā)生磷酸化修飾,進而抑制TAp73的功能活性。在OS細胞中蛋白質(zhì)Co-IP實驗顯示PLK2和TAp73可發(fā)生直接物理結合,并且發(fā)現(xiàn)陽性結果與OS細胞中內(nèi)源性TAp73蛋白豐度有關。而后,磷酸化WB實驗檢測到發(fā)生了磷酸化修飾的TAp73蛋白。另一方面,經(jīng)構建TAp73蛋白定點突變(丙氨酸殘基代替突變位點氨基殘基)的表達載體和正常TAp73、PLK2的表達載體進行了體外激酶實驗。實驗結果也表明PLK2可催化正常TAp73和T27定點突變的TAp73發(fā)生磷酸化修飾,而S48位點突變的TAp73蛋白中未能檢測到磷酸化TAp73蛋白。因此進一步驗證了PLK2可催化TAp73的S48位點發(fā)生磷酸化修飾,且是一個新的作用位點。4.PLK2對TAp73轉(zhuǎn)錄活性影響及其相互作用機制探討。上述數(shù)據(jù)分析和細胞內(nèi)、外分子生物學實驗確定了PLK2可催化高豐度的TAp73發(fā)生磷酸化修飾。本部分實驗則明確了在OS細胞中PLK2能夠抑制TAp73的轉(zhuǎn)錄活性、二者在蛋白水平相互作用、相互影響。實驗中以DNA損傷藥刺激上調(diào)內(nèi)源性TAp73豐度�；虮磉_水平的RT-qPCR實驗結果顯示：在正常培養(yǎng)下Saos2細胞中TAp73表達水平低,與正常對照組相比,在用PLK2抑制劑或siPLK2處理抑制PLK2的實驗組、以及轉(zhuǎn)染表達載體過表達PLK2(或TAp73)的實驗組中TAp73(或PLK2)、p21、puma的mRNA水平無顯著差異(P0.05)；而DNA損傷藥物處理組上調(diào)內(nèi)源性TAp73、PLK2后,p21、puma的mRNA水平升高,均有顯著差異(P0.01)。此外,與單純DNA損傷藥物處理組相比,siPLK2+DNA損傷藥物處理組、PLK2抑制劑+DNA損傷藥物處理組中p21、puma的mRNA水平升高,有顯著差異(P0.01),但siPLK2+siTAp73+DNA損傷藥物處理組則無顯著差異(P0.05)；而在原始表達水平高的MG63細胞中,與對照組相比,單純PLK2抑制已可見p21、puma表達上調(diào),差異有顯著性(P0.05)。蛋白水平的WB實驗結果與RT-qPCR結果基本一致。共聚焦免疫熒光實驗結果顯示,在OS細胞系Saos2中,在對照組細胞中TAp73和PLK2熒光信號均勻分布于細胞質(zhì)和細胞核內(nèi),而在siRNA沉默PLK2細胞中,TAp73熒光信號則多分布于細胞核內(nèi)。此外,PLK2半衰期實驗檢測顯示,在對照組細胞中PLK2半衰期約為20分鐘,而在穩(wěn)定沉默TAp73和瞬時轉(zhuǎn)染siTAp73的OS細胞中,PLK2的半衰期均縮短至約為15分鐘。5.PLK2與TAp73作用對OS細胞的生理影響及初步動物實驗研究。PLK2與TAp73相互作用導致OS細胞生理學改變。細胞周期實驗結果顯示,與正常對照組相比,在用PLK2抑制劑或siPLK2處理抑制PLK2的實驗組中Saos2細胞G1期比例減少,有顯著差異(P0.05)；DNA損傷藥物處理組中G1期細胞比例則明顯升高,有顯著差異(P0.01)；而與單純DNA損傷藥物處理組相比,siPLK2+DNA損傷藥物處理組、PLK2抑制劑+DNA損傷藥物處理組中G1期細胞比例均明顯升高,有顯著差異(P0.05)。細胞凋亡實驗結果顯示,在Saos2和U20S細胞中,與正常對照組相比,在用PLK2抑制劑或siPLK2處理抑制PLK2的實驗組中凋亡細胞比例無顯著差異(P0.05)；DNA損傷藥物處理組中凋亡細胞比例則明顯升高,有顯著差異(P0.01)；而與單純DNA損傷藥物處理組相比,siPLK2+DNA損傷藥物處理組、PLK2抑制劑+DNA損傷藥物處理組中凋亡細胞比例均明顯升高,有顯著差異(P0.01),但siPLK2+siTAp73+DNA損傷藥物處理組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),而后者與siPLK2 +DNA損傷藥物處理組、PLK2抑制劑+DNA損傷藥物處理組相比則減少,有顯著差異(P0.01)。在MG63細胞中,則單純抑制PLK2即可見凋亡細胞比例增加,差異有顯著性(P0.05)。在CCK-8檢測細胞增殖實驗中,SaOs2細胞結果顯示與對照組相比,在用PLK2抑制劑或siPLK2處理抑制PLK2的實驗組中光密度值(optical density value,ODV)增加；DNA損傷藥物處理組中ODV則在后期明顯減少,差異有顯著性(P0.05)。而與單純DNA損傷藥物處理組相比,siPLK2+DNA損傷藥物處理組中ODV在后期均明顯增加,差異有顯著性(P0.01),而siPLK2+siTAp73 +DNA損傷藥物處理組后期ODV增加了,但差異無顯著性(P0.05),但與siPLK2+DNA損傷藥物處理組相比則增加有顯著差異(P0.01)。在U20S和MG63細胞中也是類似結果。在細胞劃痕實驗中,與正常培養(yǎng)的SaOs2細胞相比,單純抑制PLK2的實驗組中創(chuàng)痕消失更快,能在3天內(nèi)愈合；DNA損傷藥物處理組在3天內(nèi)難以愈合。而siPLK2+DNA損傷藥物處理組中創(chuàng)痕不能愈合并出現(xiàn)大量凋亡細胞。但在預先siTAp73處理的SaOs2細胞也能在3天內(nèi)愈合。細胞實驗表明,PLK2可以通過TAp73影響OS細胞生存和增殖。為初步觀察在活體水平以PLK2激酶為靶向?qū)S的治療效果和了解其病理特征,我們進行了荷瘤鼠治療實驗,對瘤體組織進行了細胞和分子病理學檢查。實驗結果表明,用CDDP、或CDDP+PLK2抑制劑治療后,TAp73wt的OS裸鼠上的瘤體體積縮小,差異有顯著性(P0.01),且后一治療方案使瘤體體積縮小更明顯。它們體積治療前分別為578.200±74.780 mm3,537.976±118.333 mm3,經(jīng)過治療后則分別是87.835±31.603 mm3,237.957±122.884 mm3。相反,在TAp73null的Saos2荷瘤鼠上,單純PLK2抑制劑治療時,瘤體體積治療前是628.068±201.036 mm3,治療后卻是2280.518±1050.480 mm3,瘤體仍然在增長,差異有顯著性(P0.01)。這表明通過抑制PLK2可增強順鉑對TAp73wtOS的治療效果,而在缺乏TAp73蛋白的OS細胞中,單純用PLK2抑制劑未能觀察到治療效果。細胞病理學HE染色檢查見PLK2抑制劑治療后的TAp73wt的OS細胞比TAp73null形態(tài)小,細胞質(zhì)大而細胞核小,且細胞間結締多,惡性表型較輕。分子病理學免疫組化染色見PLK2抑制劑治療有效的OS細胞核內(nèi)TAp73陽性,且TAp73陽性越強,治療效果越好。這為最終臨床上以PLK2為靶點治療OS提供了實驗基礎和指導方案。結論：1.本研究通過醫(yī)學數(shù)據(jù)庫檢索和分析,發(fā)現(xiàn)已知14個TAp73磷酸化位點及其對應磷酸激酶；總結已知位點分布特點是位于TAp73反式激活域TA1、TA2共5個,位于TAp73非反式激活域共9個；得出修飾位點磷酸化對TAp73蛋白功能活性的調(diào)節(jié)規(guī)律是：位點在TAp73反式激活域的磷酸化修飾將下調(diào)TAp73的功能活性,而位點在TAp73非反式激活域的磷酸化為上調(diào)TAp73的功能活性。這對TAp73蛋白化學修飾后的功能預測提供了依據(jù)。也給將來利用TAp73作為基因治療手段提供了思路。2.本研究通過cDNA生物芯片高通量篩選OS細胞內(nèi)磷酸激酶靶向基因,獲得OS細胞內(nèi)的磷酸激酶表達譜和表達水平較高的10種磷酸激酶,為后續(xù)OS分子機制、信號通路等研究提供了平臺,并篩選出了4種酸性激酶CK1、CK2、PLK1和PLK2為潛在關鍵靶激酶,并首次提出PLK2是一個調(diào)節(jié)TAp73功能活性的關鍵激酶靶點。3.本研究利用生物信息數(shù)據(jù)分析形成理論指導實際實驗,首次證實了在OS細胞中PLK2可磷酸化高豐度TAp73,并發(fā)現(xiàn)了一個新的TAp73磷酸化修飾位點S48。還初步探討了在OS細胞中PLK2作為腫瘤促進因子的分子機制——通過結合TAp73延長自身半衰期,并阻止轉(zhuǎn)錄因子TAp73核轉(zhuǎn)位,下調(diào)TAp73轉(zhuǎn)錄活性而抑制TAp73下游基因p21, puma表達,從而使細胞快速通過G1期,抑制細胞凋亡,促進細胞增殖和遷徙。因此,PLK2是一個潛在的OS分子治療靶點。在研究中成功構建OS荷瘤鼠模型,初步觀察和總結了PLK2抑制劑治療后OS的細胞和分子病理學特點。4.本研究發(fā)現(xiàn),DNA損傷藥物上調(diào)內(nèi)源性TAp73、PLK2的表達水平后,PLK2可通過高豐度TAp73影響OS細胞生存、生長,并且發(fā)現(xiàn)抑制PLK2可挽救TAp73抗OS活性,增強DNA損傷藥物CDDP、ADM等的抗腫瘤效果。但在缺乏TAp73蛋白的OS細胞中,單純用PLK2抑制劑未能觀察到治療效果。這為臨床上治療以TAp73高表達為特征的惡性腫瘤提供了實驗基礎和指導依據(jù)。
【圖文】：

又位于腫癖細胞染色體異常的敏感部位，，ｐ７３化因被研究者們認為是重耍逡逑的的腫瘤抑制因子。而后續(xù)火量的駐礎實驗研究也充分印證了其抗腫瘤功能。逡逑ｐ７３基因位于染色體ｌｐ３６，山１４個外顯子，２個肩動子（圖１－４）邋［３７１。兩個啟動逡逑子轉(zhuǎn)錄翻詳?shù)模穑罚车鞍追謩e為ＴＡｐ７３和ＤＮｐ７３