【摘要】：谷氨酰胺代謝在多種腫瘤中都出現(xiàn)了異常升高,它可以為腫瘤細(xì)胞生長提供能量、穩(wěn)定的氧化還原環(huán)境和大分子物質(zhì)合成底物,同時(shí)也為治療腫瘤提供了種途徑。體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究表明,通過多種途徑抑制谷氨酰胺代謝可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。但在腫瘤細(xì)胞的研究中,通常需要使用兩種或多種藥物。明確谷氨酰胺代謝抑制對常規(guī)化療藥物在腫瘤治療作用中的影響具有重要意義。然而,關(guān)于谷氨酰胺代謝抑制對常規(guī)化療藥物作用的影響及其機(jī)理研究尚不多見。細(xì)胞凋亡是腫瘤化療治療的主要機(jī)制。本試驗(yàn)以流式細(xì)胞術(shù)、蛋白印跡和熒光共聚焦等方法,研究谷氨酰胺缺失以及谷氨酰胺酶抑制劑聯(lián)合順鉑或依托泊苷引起神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制,為研究谷氨酰胺代謝抑制在腫瘤藥物治療中的作用提供理論依據(jù)。試驗(yàn)一抑制谷氨酰胺代謝對順鉑或依托泊苷引起的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響1.抑制谷氨酰胺代謝對順鉑或依托泊苷引起的乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響試驗(yàn)使用BT-549、HCC1937和HCC38細(xì)胞分別在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基或使用BPTES預(yù)處理24小時(shí)或6小時(shí),然后使用順鉑或依托泊苷作用48小時(shí),檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示,順鉑和依托泊苷可刺激細(xì)胞cleaved-PARP和cleaved-caspase3的表達(dá)。谷氨酰胺缺失或BPTES預(yù)處理可促進(jìn)順鉑或依托泊苷誘導(dǎo)的HCC1937細(xì)胞凋亡,也可提高依托泊苷(5gM)誘導(dǎo)的BT-549細(xì)胞凋亡,但是對順鉑或依托泊苷誘導(dǎo)的HCC38細(xì)胞未產(chǎn)生明顯影響,對低濃度的依托泊苷(1gM)誘導(dǎo)的BT-549細(xì)胞凋亡或高濃度的順鉑(10μM)誘導(dǎo)的HCC1937細(xì)胞凋亡有抑制作用,顯示出劑量特異性。2.抑制谷氨酰胺代謝對順鉑或依托泊苷引起的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響試驗(yàn)采用谷氨酰胺酶Ⅰ抑制劑BPTES和968或谷氨酰胺缺失的培養(yǎng)基處理細(xì)胞6小時(shí)或24小時(shí),然后使用順鉑或依托泊苷作用于TET21N、SK-N-BE(2)和SK-N-AS細(xì)胞24小時(shí)。檢測細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3活性和cleaved-PARP表達(dá),結(jié)果顯示,抑制劑和藥物聯(lián)合作用對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生了拮抗作用,谷氨酰胺缺失未對順鉑或依托泊苷引起的SK-N-BE(2)和SK-N-AS細(xì)胞caspase-3舌性產(chǎn)生明顯的影響,但是極顯著提高了順鉑而極顯著降低了依托泊苷誘導(dǎo)的TET21N細(xì)胞caspase-3活性和cleaved-PARP表達(dá),且無劑量特異性。試驗(yàn)二谷氨酰胺缺失對順鉑或依托泊苷誘導(dǎo)的TET21N細(xì)胞凋亡的影響1.谷氨酰胺缺失聯(lián)合順鉑或依托泊苷對TET21N細(xì)胞凋亡的影響試驗(yàn)采用谷氨酰胺缺失的培養(yǎng)基處理TET21N細(xì)胞24小時(shí),然后使用順鉑或依托泊苷作用24小時(shí)。Caspase-3活性和cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、 cleaved-PARP、p-γH2Ax、p53、caspase-8、Bid、FLIP-S的表達(dá)以及cytochrome c的釋放結(jié)果顯示,由順鉑刺激的TET21N細(xì)胞凋亡顯著增加,但依托泊苷刺激產(chǎn)生的凋亡卻顯著降低,且不依賴于NMYC的表達(dá)。結(jié)果表明,谷氨酰胺缺失對順鉑或依托泊苷的作用同時(shí)涉及內(nèi)源性和caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。2.谷氨酰胺缺失對依托泊苷和順鉑的作用具有時(shí)間依賴性試驗(yàn)采用TET21NMYC+細(xì)胞在谷氨酰胺缺失的培養(yǎng)基中預(yù)處理24小時(shí),然后使用順鉑或依托泊苷作用6小時(shí)、10小時(shí)、14小時(shí)和18小時(shí),檢測細(xì)胞cleaved-PARP表達(dá)和caspase-3活性。結(jié)果顯示,谷氨酰胺缺失對依托泊苷的凋亡誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的趨勢,而對順鉑的凋亡促進(jìn)作用則隨時(shí)間逐漸增加。試驗(yàn)三谷氨酰胺缺失聯(lián)合順鉑或依托泊苷促進(jìn)或抑制TET21N細(xì)胞凋亡的機(jī)制1.谷氨酰胺缺失聯(lián)合順鉑或依托泊苷對TET21N細(xì)胞和線粒體氧呼吸功能的影響采用同試驗(yàn)二第一小節(jié)的試驗(yàn)處理方式。通過電極探頭檢測,發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺缺失或聯(lián)合順鉑可顯著降低線粒體氧消耗量和細(xì)胞鈣離子的攝取。谷氨酰胺缺失可降低依托泊苷和順鉑刺激產(chǎn)生的BAX表達(dá),并促進(jìn)順鉑但抑制依托泊苷引起的Bid(p15)的表達(dá),但對親環(huán)素D的表達(dá)不產(chǎn)生明顯影響。使用環(huán)孢霉素A和米酵菌酸抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔成分親環(huán)素D和酰胺酸轉(zhuǎn)移酶,發(fā)現(xiàn)兩種抑制劑僅可輕微減弱順鉑和依托泊苷以及聯(lián)合谷氨酰胺缺失引起的細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明,谷氨酰胺缺失對線粒體呼吸功能和細(xì)胞膜鈣離子通道都造成了影響,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔以及Bid(p15)和BAX共同介導(dǎo)了線粒體膜通透性升高而引起細(xì)胞凋亡。2. Caspase、AIF和ROS在谷氨酰胺缺失聯(lián)合順鉑或依托泊苷引起的TET21N細(xì)胞凋亡中的作用采用同試驗(yàn)二第一小節(jié)的試驗(yàn)處理方式,同時(shí)使用caspase抑制劑ZVAD預(yù)處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺缺失對順鉑的凋亡刺激作用被顯著抑制。線粒體AIF的釋放結(jié)果顯示谷氨酰胺缺失可促進(jìn)AIF的釋放,表明AIF和caspase |司時(shí)介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。采用MitoSOX檢測線粒體ROS產(chǎn)生,并使用NAC抑制ROS產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺缺失可引起ROS水平增加,抑制ROS產(chǎn)生可以完全抑制谷氨酰胺缺失聯(lián)合順鉑引起的細(xì)胞凋亡和DNA損傷,但不能完全消除谷氨酰胺缺失對依托泊苷的凋亡抑制作用,表明谷氨酰胺缺失主要是通過促進(jìn)ROS產(chǎn)生來增加順鉑的凋亡誘導(dǎo)作用,ROS的產(chǎn)生是引起DNA損傷的上游信號。結(jié)論：谷氨酰胺代謝抑制促進(jìn)了順鉑或依托泊苷誘導(dǎo)的HCC1937細(xì)胞凋亡,并顯示出劑量特異性,對BT-549和HCC38細(xì)胞未產(chǎn)生顯著影響。谷氨酰胺酶抑制劑與順鉑或依托泊苷聯(lián)合作用對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生了拮抗作用。谷氨酰胺缺失可促進(jìn)順鉑但抑制依托泊苷誘導(dǎo)的TET21N細(xì)胞凋亡,且不依賴于NMYC的表達(dá)。谷氨酰胺缺失對順鉑或依托泊苷的作用涉及內(nèi)源性、caspase-8和AIF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。谷氨酰胺的缺失主要通過刺激ROS產(chǎn)生而引起DNA損傷,進(jìn)而增加順鉑的細(xì)胞毒性。本試驗(yàn)首次采用谷氨酰胺代謝抑制聯(lián)合順鉑或依托泊苷作用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞來研究細(xì)胞凋亡及機(jī)制,為腫瘤聯(lián)合用藥研究提供了理論基礎(chǔ),也為研究谷氨酰胺代謝抑制在腫瘤藥物治療中的作用提供了理論參考。
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圖片說明： 圖３－１乳腺癌細(xì)胞的ＣＭＹＣ巧達(dá)（Ｄ，巧Ｗ及在依巧泊巧或順鈕作用Ｋ的存活率（Ａ，邋Ｂ，Ｃ）逡逑Ｆｉｇ．３－１邋ＣＭＹＣ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｃｅｌｌｓ邋（Ｄ，邋Ｅ）邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋化邋ｃｉｓｐｌａｔｉｎ逡逑ａｎｄ邋ｅＵＤｐｏｓｉｄｅ邋（Ａ，良，Ｃ）逡逑表３－１不同乳腺癌細(xì)胞對順鉆或依托泡巧的ＩＣ５０逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－１邋ＩＣ５０邋ｏｆ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｏ邋ｃｉｓｐｌａｔｉｎ邋ａｎｄ邋ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ逡逑細(xì)胞系邐依托泊巧（＾ｌＭ）邐順鋼（＾ｌＭ）逡逑ＢＴ－５４９邐７．４９±１．０８邐６．０４±１．０５逡逑ＨＣＣ１９３７邐１１．１６±１．１９邐１４．７７±１．１２逡逑ＨＣＣ３８邐１．６８止邋１．１８邐７．４９止邋１．０４逡逑其次，試驗(yàn)用谷l酷胺缺失的培養(yǎng)基預(yù)處理乳腺癌細(xì)胞２４小時(shí)，然后加入不逡逑同濃度的順巧或依托泊巧作用４８小時(shí)。采用ＣＣＫ－８試劑盒檢測細(xì)胞的增殖情逡逑
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【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Caspase Family Proteases and Apoptosis[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年11期

本文編號：2514182