【摘要】：研究背景和目的肝癌發(fā)生是一個(gè)慢性的、多基因、多途徑、多階段的復(fù)雜過(guò)程。肝癌最主要的危險(xiǎn)性因素包括慢性肝炎病毒感染(HBV和HCV)、長(zhǎng)期過(guò)量酒精攝入、食物中黃曲霉毒素B1攝入、遺傳性肝病和肝硬化等。近年來(lái),人們研究發(fā)現(xiàn)代謝疾病如糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝病等也是肝癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素。大量臨床流行病學(xué)研究證實(shí),大部分肝癌都是在慢性肝損傷、肝臟炎癥背景下發(fā)展而來(lái),通常經(jīng)由慢性肝病發(fā)展到肝纖維化、肝硬化,最后惡化形成腫瘤。肝臟的慢性損傷和炎癥背景為腫瘤形成提供了合適的細(xì)胞轉(zhuǎn)化環(huán)境。目前,肝癌發(fā)生特別是從慢性肝損傷惡性轉(zhuǎn)化形成腫瘤的確切分子機(jī)制尚不完全清楚。Gankyrin又稱(chēng)為(p28或PSMD10)是在肝癌中高表達(dá)的癌蛋白。近幾年的研究表明Gankyrin還在其他腫瘤,包括食管鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、膽管癌、口腔上皮細(xì)胞癌以及肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)。研究顯示Gankyrin在腫瘤相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有非常重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)Gankyrin可與p16競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4,促進(jìn)RB蛋白的磷酸化降解,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期紊亂,促進(jìn)增殖：還可通過(guò)與MDM2相互作用,增加p53的泛素化降解,抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果還表明Gankyrin可直接結(jié)合RelA,促進(jìn)NF-κB出核,抑制其轉(zhuǎn)錄活性；可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路,促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移；能通過(guò)抑制Oct4的降解,增強(qiáng)肝癌腫瘤前體細(xì)胞干細(xì)胞潛能。這些結(jié)果表明Gankyrin通過(guò)調(diào)控多條重要的信號(hào)通路,在肝癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。在DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型中,除了在肝癌組織中高表達(dá)外,Gankyrin在肝損傷及肝纖維化階段即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),這提示我們Gankyrin可能在肝癌發(fā)生的早期階段或者說(shuō)在肝損傷、肝纖維化向肝癌惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著調(diào)控作用。目前尚未見(jiàn)到Gankyrin在肝損傷及肝癌發(fā)生的癌前階段發(fā)揮作用的相關(guān)報(bào)道,本課題旨在通過(guò)在肝臟特異性過(guò)表達(dá)癌蛋白Gankyrin的轉(zhuǎn)基因小鼠基礎(chǔ)上構(gòu)建經(jīng)由慢性肝損傷、肝纖維化、肝硬化到肝癌的動(dòng)物模型,研究Gankyrin在這一惡性進(jìn)展過(guò)程中的作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法：1.臨床組織樣本檢測(cè)：免疫組織化學(xué)染色及western blot法檢測(cè)肝硬化患者肝臟組織樣本中Gankyrin的蛋白表達(dá)水平,并分別利用Image J和Odyssey軟件進(jìn)行半定量分析,統(tǒng)計(jì)肝硬化樣本與血管瘤遠(yuǎn)端正常肝組織中Gankyrin表達(dá)的差異。2. Gankyrin過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建、繁殖與鑒定：構(gòu)建由Albumin啟動(dòng)子連接gankyrin全長(zhǎng)cDNA的載體,以構(gòu)建Gankyrin在肝臟中特異性過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠(gankyrinhep小鼠)。將Found鼠與野生小鼠交配,繁殖得到Fl代gankyrinhep小鼠,經(jīng)鑒定后,用于后續(xù)擴(kuò)增繁殖與實(shí)驗(yàn)研究。3.四氯化碳(Carbon Tetrachloride, CCl4)誘導(dǎo)肝損傷模型構(gòu)建：每周3次CCl4注射,持續(xù)16周,收取不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠樣品,檢測(cè)肝損傷及纖維化相關(guān)指標(biāo)。小鼠血清ALT和AST水平測(cè)定檢測(cè)肝功能；肝臟HE染色,檢測(cè)肝臟的組織結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞壞死情況；TUNEL染色檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況；western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)分子變化;利用天狼星紅染色檢測(cè)野生組和gankyrinhep組肝纖維化情況；收集肝組織RNA,行real-time PCR,檢測(cè)肝纖維化相關(guān)標(biāo)志物變化；肝組織切片進(jìn)行a-SMA免疫組化和DESMIN免疫熒光染色檢測(cè)肝星狀細(xì)胞活化情況；F4/80免疫組化檢測(cè)炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)情況；收集小鼠血清行ELISA檢測(cè)相關(guān)炎癥因子分泌情況。4.小鼠肝癌動(dòng)物模型構(gòu)建：DEN誘癌模型,小鼠出生后15天腹腔注射DEN后9個(gè)月后觀(guān)察野生對(duì)照組與轉(zhuǎn)基因組的肝癌形成情況；DEN聯(lián)合CCl4誘癌模型,DEN處理聯(lián)合分籠后每周一次CCl4給藥,不同時(shí)間后觀(guān)察兩組之間腫瘤形成情況差異；持續(xù)CCl4誘癌模型,小鼠出生后4周后腹腔注射CCl4,每周三次,16周后觀(guān)察腫瘤形成情況。5.機(jī)制探索：(1)不同時(shí)間點(diǎn)CCl4處理的野生對(duì)照和gankyrinhep小鼠肝臟樣品中檢測(cè)JNK及其他相關(guān)通路變化情況；CCl4處理2周后分選小鼠原代肝細(xì)胞,western blot檢測(cè)JNK通路活化情況。(2)CCl4處理的小鼠肝臟組織樣品進(jìn)行Racl激酶活性檢測(cè)；免疫共沉淀檢測(cè)gankyrin對(duì)RhoGDIa與Racl抑制性相互作用的影響。(3)2周CCl4處理的小鼠肝臟組織樣品進(jìn)項(xiàng)RhoA、ROCK激酶活性檢測(cè)；免疫共沉淀檢測(cè)gankyrin對(duì)RhoGDIa與RhoA相互作用的影響。(4)對(duì)CCl4處理小鼠同時(shí)給予Racl小分子抑制劑處理小鼠2周,檢測(cè)對(duì)JNK活性的調(diào)節(jié)。(5)對(duì)CCl4處理小鼠同時(shí)給予JNK抑制劑或Rac1抑制劑,western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)分子變化；天狼星紅染色檢測(cè)肝纖維化情況；ELISA檢測(cè)炎癥因子分泌情況。(6)CCl4處理小鼠16周期間同時(shí)給予JNK抑制劑3個(gè)月,觀(guān)察肝臟腫瘤形成情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.與正常肝臟樣本肝硬化患者肝臟組織中g(shù)ankyrin表達(dá)升高(P0.05)。2.短時(shí)間CCl4處理的gankyrinhep組肝細(xì)胞壞死和凋亡較野生對(duì)照組多,即肝損傷加重。3.CCl4處理2周、4周和8周時(shí),gankyrinhep組的肝纖維化以及星狀細(xì)胞活性化均較野生組增強(qiáng)；gankyrinhep組的肝臟損傷及炎癥反應(yīng)加重,同時(shí)代償性增殖明顯高于野生對(duì)照。4. DEN/CCl4誘導(dǎo)肝癌形成過(guò)程中g(shù)ankyrinhep組的腫瘤數(shù)目和腫瘤大小均明顯高于野生對(duì)照組：同時(shí)肝纖維化在gankyrinhep組明顯加重;而DEN誘癌模型中,gankyrinhep組與野生對(duì)照組腫瘤形成情況無(wú)明顯差異。5.CCl4單獨(dú)處理16周后在gankyrinhep組有50%小鼠形成腫瘤,而在野生組無(wú)腫瘤形成。6.CCl4處理的gankyrinhep組呈現(xiàn)JNK通路相對(duì)野生對(duì)照組持續(xù)增強(qiáng)活化。7.CCl4處理的gankyrinhep組的Rac1激酶持續(xù)活化；gankyrin通過(guò)抑制RhoA/ROCK通路進(jìn)而活化Rac1; Rac1抑制劑處理導(dǎo)致gankyrinhep組JNK活性恢復(fù)至野生水平。8.JNK抑制劑或Rac1抑制劑均能緩解CCl4誘導(dǎo)的gankyrinhep組的細(xì)胞凋亡增加和炎癥因子分泌增多。9.JNK抑制劑可有效抑制長(zhǎng)期CCl4處理后gankyrinhep組肝癌形成。結(jié)論：本研究主要從動(dòng)物體內(nèi)水平證明Gankyrin對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷向肝癌進(jìn)展的惡性轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用。Gankyrin通過(guò)調(diào)節(jié)RhoGDI與RhoA的相互作用,下調(diào)RhoA的活性,進(jìn)而增強(qiáng)Racl活性,導(dǎo)致CCl4處理過(guò)程中JNK通路的持續(xù)活化,促進(jìn)肝損傷加重,炎癥反應(yīng)加強(qiáng),肝細(xì)胞代償性增生加強(qiáng),肝纖維化加重并惡性轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致肝癌形成。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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