【摘要】：腫瘤源性血栓形成特指由于明確腫瘤誘因所導致的血栓形成和血栓栓塞。在動脈系統(tǒng)主要要表現(xiàn)為腦中風和心肌梗死,其發(fā)病率為1.5%-3.1%不等；而靜脈系統(tǒng)受累主要包括深靜脈血栓形成和肺動脈栓塞,發(fā)病率約有15%-20%,同時近5%的腫瘤患者是在進行其他項目檢查時意外發(fā)現(xiàn)肺栓塞。腫瘤的發(fā)生部位、類型、分期、分級,及治療方法都會影響腫瘤患者發(fā)生靜脈血栓的發(fā)病率,其中腫瘤類型被認為與發(fā)病率的關系最為密切,大量研究表明肺癌,胰腺癌,胃癌,卵巢癌等腫瘤患者較其他腫瘤患者更容易出現(xiàn)靜脈血栓,其原因多與腺癌細胞分泌大量黏蛋白等促凝因子相關。目前,靜脈血栓形成已經(jīng)成為癌癥患者除去原發(fā)腫瘤外的首要死亡原因,是影響腫瘤患者治療和預后的重要危險因素。由于腫瘤患者同時存在血液高凝狀態(tài)和凝血功能紊亂,同時腫瘤患者體內的靜脈血栓除去血液成分以外還摻雜有腫瘤細胞,因此在接受常規(guī)抗凝治療后,治療效果并不滿意,甚至伴有大出血的風險。因而探明腫瘤誘導血栓形成的具體機制,尋找到新的腫瘤源性靜脈血栓治療方向成為目前的研究熱點。腫瘤誘導血栓形成主要包括兩方面：一是腫瘤細胞憑借自身的高侵襲性穿過血管內皮屏障進入血液循環(huán)系統(tǒng)；二是與血液成分接觸的腫瘤細胞通過相關機制調節(jié)促凝因子的釋放,在引發(fā)血栓形成的同時隨著血液循環(huán)進行遠處轉移。目前,腫瘤誘導靜脈血栓形成的研究焦點已不再集中于半胱氨酸蛋白酶對于直接因子X的激活,而是轉向以組織因子相關凝血途徑為代表的外源性凝血途徑的激活。腫瘤細胞表達的組織因子和粘蛋白被認為在血栓形成過程中起到重要促凝作用。組織因子的大量釋放不僅有助于原癌基因的表達和抑癌基因的抑制,同時還協(xié)助腫瘤血管生成從而增強腫瘤細胞的侵襲性。去整合素金屬蛋白酶(A disintegrin and metalloproteases, ADAMs)是一類具有八個不同結構域的1型跨膜蛋白,因該族蛋白含有金屬蛋白酶結構域和去整合素結構域,因此被認為在細胞分化和遷移過程中對于細胞因子和粘附分子的釋放起到重要作用。ADAM 17因為對腫瘤相關因子的分泌有促進功能因此已經(jīng)在腫瘤細胞中得到深入研究,與其結構極為相似的ADAM 10最初在阿爾茨海默癥的研究中得到廣泛關注,因此其研究多集中在神經(jīng)和胚胎系統(tǒng),而在腫瘤領域的研究正逐步展開。本研究將探討在腺癌細胞系中ADAM 10對于腫癌遷移能力和侵襲性的影響,以及對于相關促凝血因子分泌的調節(jié)作用,從而為腫瘤患者靜脈血栓治療新靶點的研究提供理論支持。第一部分ADAM10對腺癌細胞遷移力和侵襲性的調節(jié)目的：為了明確ADAM10在mRNA和蛋白水平的降低是否會引起四種腺癌細胞的遷移能力和侵襲性發(fā)生相應變化。方法：對人非小細胞肺腺癌細胞系A549,人結直腸腺癌上皮細胞系DLD-1,人乳腺癌細胞系MCF-7和人胰腺導管腺癌細胞系PANC-1四種腺癌細胞進行分組設置,其中進行ADAM10小RNA干擾(Small interfering RNA, siRNA)的細胞為實驗組,未經(jīng)過轉染處理的細胞為對照組。首先使用免疫熒光的方法檢測目的分子在腺癌細胞中的表達情況：其次分別使用劃痕實驗檢驗其遷移能力的改變；[ranswell實驗檢測其侵襲能力的改變；同時使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real time polymerase chain reaction, Real-Time PCR)和蛋白質印跡法(Western Blot)檢測ADAM10,粘蛋白MUCl和VEGFR-2在mRNA和蛋白水平的改變。結果：在免疫熒光結果中,四種腺癌細胞膜表面均可以見到ADAM10, MUC1和VEGFR-2的表達。進行ADAM10 siRNA轉染后,四種腺癌細胞實驗組較其對照組在遷移能力和侵襲能力方面均減弱。在mRNA水平, ADAM10在PANC-1中表達最多,MUC1在MCF-7中表達最多, VEGFR-2在PANC-1中表達最多；在蛋白水平, ADAM10在A549中表達最高,MUC1在MCF-7表達最高,VEGFR-2在A549中表達最高。ADAM10, MUC1和VEGFR-2在mRNA和蛋白水平的表達在實驗組較對照組均有所下降。結論：ADAM10在mRNA和蛋白水平的表達降低能夠引起四種腺癌細胞的遷移能力和侵襲能力發(fā)生減弱,這種減弱可能與MUC1和VEGFR-2的表達降低相關。第二部分ADAM10對腺癌細胞促凝血因子釋放的調節(jié)目的：為了明確ADAM 10在mRNA和蛋白水平的降低是否會引起四種腺癌細胞所分泌的促凝血相關因子的表達發(fā)生相應變化。方法：將四種腺癌細胞根據(jù)是否進行ADAM10siRNA轉染分為實驗組和對照組。使用免疫熒光的方法檢測目的分子在腫瘤細胞中的表達情況；Real-Time PCR和Wsetern Blot方法分別檢測ADAM 10, PSGL-1和TF在mRNA和蛋白水平的改變。結果： 在免疫熒光結果中,四種腺癌細胞中均可以見到ADAM 10, PSGL-1和TF在細胞膜表面表達。進行ADAM 10 siRNA轉染后,在mRNA水平,ADAM 10在PANC-1中表達最多,PSGL-1在PANC-1中表達最多,TF在DLD-1中表達最多：在蛋白水平,ADAM 10在A549中表達最高,PSGL-1在PANC-1表達最高,TF在A549中表達最高。在Real-Time PCR和Wsetern Blot結果中,經(jīng)過轉染處理后的實驗組中所有目的分子的表達均較對照組有所下降。結論：ADAM 10在mRNA和蛋白水平的表達降低能夠引起四種腺癌細胞所分泌的凝血相關因子PSGL-1和TF的表達相應減少,這種調控與腫瘤源性靜脈血栓形成中的高凝狀態(tài)改變相關。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2

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本文編號：2513501