發(fā)布時(shí)間：2019-07-11 19:01

【摘要】：轉(zhuǎn)移是引起惡性腫瘤死亡的主要生物學(xué)特性和原因。腫瘤轉(zhuǎn)移的步驟包含相應(yīng)的順序以及相關(guān)聯(lián)的步驟過(guò)程,其中很多步驟受到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。腫瘤細(xì)胞獲得間充質(zhì)特性的能力,可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力、誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性,并抑制細(xì)胞凋亡和程序性衰老,使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過(guò)程已經(jīng)被報(bào)道在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用包括結(jié)腸癌(CRC)。結(jié)腸癌(CRC)是發(fā)生在結(jié)腸部位的消化道腫瘤,為我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,近年來(lái)發(fā)病率不斷增高,嚴(yán)重危害了人們的身體健康。在美國(guó),因癌癥死亡的惡心腫瘤中結(jié)腸癌(CRC)位居第三位,據(jù)報(bào)告每年大約造成50000人左右死亡。雖然手術(shù)結(jié)合輔助治療提高了結(jié)腸癌(CRC)的預(yù)后生存率,但是仍有大約一半的患者發(fā)生了轉(zhuǎn)移。抑制結(jié)腸癌(CRC)的轉(zhuǎn)移是改善結(jié)腸癌(CRC)的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后的有效治療策略。微小RNA(miRNAs)是一類通過(guò)與靶基因的3′非編碼區(qū)(UTR)相結(jié)合,從而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因蛋白表達(dá)水平的非編碼單鏈小核糖核酸(RNA)分子。一些研究表明miRNAs可以作為調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要抑制劑或啟動(dòng)子。SMAD蛋白家庭成員3(Smad3)作為TGF-β信號(hào)通路的下游的一個(gè)關(guān)鍵因素,同時(shí)也是惡性腫瘤如結(jié)腸癌(CRC)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的一個(gè)至關(guān)重要的誘導(dǎo)物。TGF-β結(jié)合兩個(gè)跨膜受體,I型(TGFBRI)和II型(TGFBRII),導(dǎo)致Smad2(p-s Smad2)和Smad3(p-Smad3)磷酸化,同時(shí)活化物在細(xì)胞核內(nèi)與Smad4相結(jié)合,結(jié)合物可以調(diào)節(jié)下游上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因的表達(dá)。有研究確認(rèn),Smad3是micro RNA-140-5p(miR-140)的直接靶點(diǎn)。miR-140首次明確發(fā)現(xiàn)是于斑馬魚(yú)和小鼠胚胎的軟骨發(fā)育包括長(zhǎng)和扁骨發(fā)生發(fā)展中,miR-140可以抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞(CSC)的生存和轉(zhuǎn)移可能通過(guò)抑制Smad2和自噬來(lái)完成的。下調(diào)miR-140誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移可能是通過(guò)調(diào)控靶基因Slug來(lái)完成的。miR-140在影響結(jié)腸癌(CRC)侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。第一部分miR-140靶向調(diào)控Smad3基因的表達(dá)研究目的:驗(yàn)證Smad3確為miR-140的靶點(diǎn)。方法:在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和RKO中通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,使miR-140上調(diào)或者下調(diào),并且同時(shí)轉(zhuǎn)染沉默Smad3的模擬物(si RNA),通過(guò)q RT-PCR測(cè)量轉(zhuǎn)染后,miR-140的表達(dá)高低變化,以及Smad3 m RNA。應(yīng)用免疫印跡的方法檢測(cè)Smad3和p-Smad3蛋白變化,來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染率,以及小RNA miR-140與基因Smad3之間的關(guān)系。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR140對(duì)細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)miR-140對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO細(xì)胞克隆形成能力的影響;結(jié)果:通過(guò)熒光q RT-PCR檢測(cè),轉(zhuǎn)染miR-140的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO中與對(duì)照組相比,miR140組中的miR-140表達(dá)增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與對(duì)照組相比,上調(diào)miR-140后Smad3 m RNA含量無(wú)增減變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫印跡結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比miR-140組Smad3和p-Smad3的蛋白含量降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),并且抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞克隆形成的能力(P0.01)。而在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO中轉(zhuǎn)染,使miR-140低表達(dá)能使細(xì)胞中Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)增高(P0.01),并且促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞的克隆形成能力;而miR-140抑制劑和Smad3 si RNA共轉(zhuǎn)染對(duì)Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)和腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞的克隆形成能力無(wú)明顯影響(P0.05)結(jié)論:上調(diào)miR-140可使Smad3和p-Smad3表達(dá)降低,但不影響Smad3 m RNA的表達(dá),并且抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng):相反使miR-140的表達(dá)降低,可升高Smad3和p-Smad3的含量,并且促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。miR-140能夠靶向調(diào)控基因Smad3的表達(dá)來(lái)影響腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞的克隆形成能力。第二部分miR-140調(diào)控EMT的作用機(jī)制研究目的:通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討miR-140調(diào)控EMT對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO遷移和侵襲能力的影響。方法:在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和RKO中通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,使miR-140上調(diào)或者下調(diào),并且同時(shí)轉(zhuǎn)染沉默Smad3的模擬物(si RNA),通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn),研究高表達(dá)或低表達(dá)miR-140對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和RKO遷移和侵襲能力的作用方式。免疫印跡和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法研究EMT相關(guān)蛋白E-cadherin及Vimentin的含量變化。探討miR-140在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用及其調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比miR-140組細(xì)胞的遷移能力減弱,細(xì)胞的遷移距離具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,與Con和NC等對(duì)照組相比,miR-140組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。EMT相關(guān)分子E-cadherin表達(dá)增高,而Vimentin表達(dá)減少(P0.01)。si Smad3組與miR-140組的作用相比,其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Con和NC等對(duì)照組相比使miR-140表達(dá)降低,促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),EMT相關(guān)分子E-cadherin表達(dá)減少,而Vimentin表達(dá)增高(P0.01)。而miR-140抑制劑和Smad3 si RNA共轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的遷移和侵襲能力無(wú)明顯變化(P0.05)。結(jié)論:miR-140的過(guò)表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO的遷移和侵襲能力,阻滯了EMT的發(fā)生;miR-140的表達(dá)降低則促進(jìn)EMT的發(fā)生,增高結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO的遷移和侵襲能力。同時(shí)使miR-140表達(dá)降低和沉默Smad3,則對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和RKO遷移和侵襲的能力和EMT的發(fā)生無(wú)明顯影響。第三部分miR-140對(duì)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用目的:探討過(guò)表達(dá)miR-140抑制裸鼠移植瘤的機(jī)制方法:將裸鼠通過(guò)背部或尾靜脈注射的方法,各組分別注射慢病毒感染的miR-140細(xì)胞、陰性對(duì)照細(xì)胞、和沉默Smad3的細(xì)胞,并采用免疫組織化學(xué)染色和western blotting技術(shù)分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:過(guò)表達(dá)miR-140組或下調(diào)Smad3組移植瘤體積較小,生長(zhǎng)緩慢并且轉(zhuǎn)移率較低。腫瘤組織中Smad3,p-Smad3,Vimentin和Zeb1表達(dá)減低,E-cadherin表達(dá)增高。結(jié)論:過(guò)表達(dá)miR-140能明顯抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng),并可能通過(guò)抑制Smad3蛋白的表達(dá)來(lái)完成的。
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圖片說(shuō)明： 定量 qPCR：結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的 HCT116 和 RKO 細(xì)胞中 miR-140 表達(dá)水平與 NC增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**:p<0.01）。0 上調(diào)對(duì) Smad3 表達(dá)的影響生物信息學(xué)軟件 TargetScan（www.targetscan.com）分析結(jié)果提示，miRNA3'-UTR 端存在互補(bǔ)配對(duì)（圖 1-2）。圖 1-2 miR-140 與 Smad3 序列配對(duì)結(jié)果tern blotting(免疫印跡)結(jié)果示，與 Con 和 NC 照組相比，miR-140 可以使 Smad3 和 p-Smad3 的蛋白異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**:p<0.01），而與 Smad3 siRNA 組水平相當(dāng)（圖
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圖片說(shuō)明： 表達(dá)水平為其的 1.09 和 1.167 倍，兩者之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p> 0.05，，圖 1-1）。 1-1 熒光定量 qPCR：結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的 HCT116 和 RKO 細(xì)胞中 miR-140 表達(dá)水平與 NC 組和ntrol 組顯著增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**:p<0.01）。 miR-140 上調(diào)對(duì) Smad3 表達(dá)的影響2.1 通過(guò)生物信息學(xué)軟件 TargetScan（www.targetscan.com）分析結(jié)果提示，miR-140 Smad3 mRNA3'-UTR 端存在互補(bǔ)配對(duì)（圖 1-2）。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.35

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本文編號(hào)：2513400