【摘要】：1研究背景骨肉瘤(osteosarcoma)是起源于原始的成骨間充質(zhì)細胞的常見的原發(fā)惡性骨腫瘤,在原發(fā)性惡性骨腫瘤中居前三位,多發(fā)生于兒童及青年人。發(fā)生部位絕大多數(shù)為四肢長管狀骨干骺端,尤其是股骨遠端、脛骨近端和肱骨近端,另外還可發(fā)生于顱骨、下頜骨和骨盆,較少發(fā)生于肋骨。在1999年到2008年,美國共發(fā)現(xiàn)有7104例骨肉瘤患者,該病已經(jīng)成為兒童及成人腫瘤相關(guān)死亡的第二大主要原因。骨肉瘤惡性程度高,進展迅速,在上世紀70年代之前,僅有單一外科手術(shù)治療,其5年生存率僅有15%-20%,大約有80%的病人死于腫瘤轉(zhuǎn)移,主要是肺部轉(zhuǎn)移。近年來,盡管骨肉瘤診斷及放化療治療手段取得了較大進步,但由于其高轉(zhuǎn)移率以及手術(shù)切除后高復發(fā)率,導致患者5年預(yù)后仍較差,并且有較高的致死率和致殘率。骨肉瘤作為一種具有高度侵襲性的腫瘤,有近20%的患者在就診時即發(fā)生轉(zhuǎn)移,而最常見的轉(zhuǎn)移部位就是肺臟。在疾病的晚期階段,大約有50%的患者發(fā)生致死性肺部轉(zhuǎn)移。既往研究顯示非轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者生存率為50%-78%,而轉(zhuǎn)移患者生存率僅為10%-20%。因此,骨肉瘤的轉(zhuǎn)移侵襲機制也越來越多的成為研究的重點,深入探討其轉(zhuǎn)移侵襲機制對于加深骨肉瘤的認識及尋找新的干預(yù)靶點和治療措施具有重要意義。惡性腫瘤最主要的病理生理學特點即為侵襲和轉(zhuǎn)移,這是導致疾病預(yù)后差的根本原因。所謂侵襲是指惡性腫瘤細胞侵入腫瘤周圍正常組織并生長增殖的現(xiàn)象；而轉(zhuǎn)移(metastasis)是指腫瘤細胞脫離原發(fā)腫瘤灶進入周圍的血管或者淋巴管,隨血液和淋巴液播散至靶器官,腫瘤細胞侵出管脈系統(tǒng)并在靶器官滯留,通過逃避自身機體的免疫破壞而在靶器官處增殖形成新的腫瘤病灶。侵襲不僅是導致術(shù)后腫瘤復發(fā)的根本原因,也是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞分泌MMPs、絲氨酸蛋白酶及半胱氨酸蛋白酶分解基底膜,脫離原位腫瘤組織,而腫瘤細胞通過顯著增加絡(luò)氨酸激酶受體(TrkB)、整合素對α2β3、腺瘤息肉病桿菌(APC)基因產(chǎn)物、黏著斑激酶、半乳凝素-3以及轉(zhuǎn)移生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)等蛋白直接抵抗失巢凋亡,幫助細胞遠處轉(zhuǎn)移。到達遠隔部位后,腫瘤細胞形成的瘤栓粘附于內(nèi)皮細胞進而穿過基底膜。在該過程中,整合素和層粘連蛋白受體以及蛋白水解酶發(fā)揮了重要作用。另外,血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟,其機制是促血管生成因子(VEGF, FGF,IL-18)與其拮抗因子(血小板反應(yīng)蛋白-1,血管抑素,乳腺絲抑蛋白)失衡,導致內(nèi)皮細胞增殖進而生成血管。由上可見,多種基因及其產(chǎn)物參與了骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,其中,整合素、TGF-β、VEGF及MMPs在其中發(fā)揮了重要作用。整合素可以直接或間接的促進腫瘤細胞向上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；整合素也可以激活VEGF信號通路誘導腫瘤血管生成；TGF-β可抑制全身免疫協(xié)助腫瘤細胞逃避宿主免疫監(jiān)視,并能調(diào)節(jié)腫瘤微循環(huán)中免疫細胞浸潤；TGF-β可通過smads,MAPKs,Ras等信號通路以及多種microRNA促進細胞轉(zhuǎn)化和新生血管生成。MMPs可降解多種細胞外基質(zhì)成分,促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。一些研究揭示了骨肉瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制。埃茲蛋白被認為是轉(zhuǎn)移決定因子,其高表達預(yù)示骨肉瘤患者預(yù)后較差。另外,肝素酶、磷酸酶-張力蛋白類似物(PTEN)以及神經(jīng)黏連因子-2也參與介導骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組蛋白水解酶,可通過降解細胞外基質(zhì),促進腫瘤細胞的局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移。大量研究發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9在骨肉瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。在正常組織中,MMP-2的表達受到如MMP組織抑制因子(TIMP)、有Kazal模體、可逆調(diào)節(jié)的半胱氨酸富集蛋白(RECK)、a2巨球蛋白等天然抑制因子的抑制；而在骨肉瘤組織中,MMP-2的表達明顯上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2陽性的骨肉瘤患者生存時間及生存率均顯著低于陰性患者,且Cox生存分析顯示MMP-2與預(yù)后密切相關(guān)。MMP-9在骨肉瘤組織中也呈現(xiàn)過表達狀態(tài),研究發(fā)現(xiàn)抑制其mRNA水平及蛋白活性,可顯著減少人骨肉瘤細胞的浸潤和侵襲。骨肉瘤組織中MMP9的過表達與RECK的減少密切相關(guān)。RECK,最初是從cDNA表達克隆分離出來的轉(zhuǎn)化抑制基因,通過編碼GPI錨定的糖蛋白下調(diào)或抑制MMPs,因此,被認為是MMPs內(nèi)源性抑制因子。近年來研究發(fā)現(xiàn),在鼻咽癌、膠質(zhì)瘤、膀胱癌、非小細胞性肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝細胞癌及前列腺癌等多種腫瘤細胞中,RECK的mRNA及蛋白表達顯著下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、胃癌、肝癌以及肺癌組織中,RECK超甲基化現(xiàn)象預(yù)示患者預(yù)后較差。這些研究結(jié)果提示RECK可能通過抑制MMPs進而抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。近年也有研究發(fā)現(xiàn)低水平RECK是骨肉瘤預(yù)后差的一個獨立預(yù)測因素。同時,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)RECK啟動子區(qū)域的甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)致癌基因RAS能夠通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b介導的啟動子甲基化而使RECK基因沉默,而應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑后能夠維持RECK的表達并可能抑制腫瘤細胞的侵襲。在非小細胞肺癌中人們也發(fā)現(xiàn)RECK在啟動子甲基化的影響下表達下調(diào)而且這種下調(diào)與K-ras基因突變以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。在口腔鱗癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)RECK啟動子甲基化與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。綜上可見,RECK在腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,但是目前較少有文獻深入研究RECK在骨肉瘤中的具體作用和機制。我們擬通過搜集正常人及骨肉瘤患者組織標本,探討不同組織中的RECK的表達情況以及RECK啟動子甲基化在骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機制。2研究目的(1)探討正常組織、局部限制性骨肉瘤與侵襲轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中RECK的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平的差異,探討TGF-β、VEGF及去甲基化制劑5-氮雜胞苷干預(yù)后RECK表達水平的變化；(2)探討不同組織中RECK啟動子區(qū)域甲基化水平的差異以及轉(zhuǎn)移性腫瘤標志物表達變化,揭示RECK的作用機制。3實驗方法3.1人骨肉瘤組織標本留取骨肉瘤標本取自大于40歲的男性人員,包括15例局部限制性骨肉瘤患者、15例原發(fā)骨肉瘤切除(多數(shù)為截肢手術(shù))后伴發(fā)浸潤轉(zhuǎn)移的患者、15例骨組織正常者(標本由非惡性原因所致死亡者尸檢所得)。每組隨機選取5個樣本進行組織提取,所有實驗重復三次以檢測不同參數(shù)變化趨勢。3.2骨肉瘤細胞的富集與培養(yǎng)從骨肉瘤組織中提取細胞并培養(yǎng),用于后續(xù)實驗。3.3細胞刺激鑒于VEGF和TGF-β在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用,我們VEGF和TGF-β刺激局部限制性骨肉瘤細胞,用以動態(tài)觀察不同組織細胞內(nèi)RECK的mRNA及蛋白的表達變化情況；同時,為探討RECK甲基化在骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移中的作用,我們加用甲基化抑制劑5-氮胞苷與細胞共培養(yǎng),檢測不同組細胞中RECK啟動子甲基化平。3.4 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別提取正常骨組織細胞、局部限制性骨肉瘤組織細胞、侵潤轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織細胞以及分別應(yīng)用VEGF和TGF-β干預(yù)的局部限制性骨肉瘤組織細胞和5-氮胞苷干預(yù)的轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織細胞的mRNA,并通過RT-PCR方法檢測不同組織細胞內(nèi)RECK的mRNA水平。3.5 DNA甲基化檢測不同組織細胞DNA組提取后應(yīng)用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA,修飾后DNA用于PCR檢測RECK啟動子甲基化水平。3.6免疫印跡(Western blot)檢測提取正常骨組織細胞及轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織細胞總蛋白,行Western blot檢測RECK蛋白表達水平。3.7 ELISAELISA用于檢測未干預(yù)的骨肉瘤組織細胞、正常骨組織細胞以及分別應(yīng)用VEGF和TGF-β干預(yù)的局限性骨肉瘤組織細胞和5-氮胞苷干預(yù)的轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織細胞的RECK蛋白表達水平。3.8統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 16.0軟件包分析所有實驗數(shù)據(jù)。采用均數(shù)±標準差表示計量資料。統(tǒng)計分析采用Oneway ANOVA或LSD post-hoc分析。P0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。4.結(jié)果4.1轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織中RECK mRNA水平降低我們對對照組、局部限制性骨肉瘤組、轉(zhuǎn)移骨肉瘤組、局部限制性骨肉瘤+VEGF組、局部限制性骨肉瘤+TGF-β組、對照+氮胞苷組、轉(zhuǎn)移骨肉瘤+氮胞苷組7個組RECK mRNA表達水平進行比較,結(jié)果顯示其在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織細胞中明顯降低,5-氮胞苷則能夠增加轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中RECK mRNA的表達,而VEGF和TGF-β則能夠抑制限制性骨肉瘤中RECK mRNA的表達。5-氮胞苷的實驗結(jié)果間接說明RECK轉(zhuǎn)錄水平的變化可能與其啟動子甲基化調(diào)節(jié)有關(guān)。4.2轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織中RECK蛋白表達減少我們應(yīng)用ELISA方法檢測了上述各組中RECK的蛋白表達情況,與mRNA水平檢測結(jié)果相似,在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織細胞中RECK蛋白的表達也顯著減少,組間差異較大,有統(tǒng)計學意義。除ELISA方法外,我們同樣進行了western blot檢測觀察RECK蛋白表達的變化,結(jié)果顯示與對照組相比,轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組RECK蛋白表達顯著降低。4.3轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織中RECK啟動子甲基化水平增加我們比較了對照組、局部限制性骨肉瘤組、轉(zhuǎn)移骨肉瘤組、局部限制性骨肉瘤+VEGF組、局部限制性骨肉瘤+TGF-P組、對照+氮胞苷組、轉(zhuǎn)移骨肉瘤+氮胞苷組7個組RECK啟動子甲基化水平。結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織中,RECK啟動子被高度甲基化修飾,VEGF和TGF-β可誘導骨肉瘤細胞呈現(xiàn)高度甲基化的表型,而這種甲基化可被5-氮胞苷所抑制。4.4轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織中相關(guān)侵襲小體蛋白標志物增加我們對在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用的4種蛋白即MMP-9、黏著斑蛋白激酶、β1/β3-整合素進行檢測。與其他組相比,轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織中這些蛋白的表達均明顯增加。5.結(jié)論1.RECK在骨肉瘤組織中表達水平顯著下降,尤其是在骨肉瘤轉(zhuǎn)移個體中其下降更為明顯,而RECK表達下降的機制為RECK基因啟動子區(qū)域的甲基化。2.骨肉瘤中,RECK表達下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移標志物如MMP9、黏著斑激酶、整合素β1和整合素β3的高表達呈相關(guān)性,提示RECK能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移而其表達下調(diào)則激活了骨肉瘤轉(zhuǎn)移。
文內(nèi)圖片：
圖片說明：圖１．轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織中ＲＥＣＫ邋ｍＲＮＡ水平降低
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1

【參考文獻】

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本文編號：2512289