【摘要】：目的肺癌是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致癌癥相關(guān)性死亡的首要原因,嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常見(jiàn)的類(lèi)型,約占肺癌總數(shù)的80%。目前依據(jù)基因型的靶向治療已經(jīng)成為NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案之一。臨床應(yīng)用靶向藥物前需要進(jìn)行基因檢測(cè)以選擇受益人群。傳統(tǒng)的組織活檢用于突變檢測(cè)存在一定的局限性,近年來(lái)循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)作為“液體活檢”的檢材備受關(guān)注,大量文獻(xiàn)比較了應(yīng)用組織和ctDNA進(jìn)行突變檢測(cè)的一致性,但各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果差異較大,歸結(jié)原因應(yīng)該是血漿ctDNA含量差異造成的。本研究擬通過(guò)分析ctDNA含量水平與突變檢測(cè)準(zhǔn)確性之間的關(guān)系,確定取得可靠突變檢測(cè)結(jié)果時(shí)的ctDNA水平。同時(shí)探討了利用細(xì)胞毒性藥物增加ctDNA含量進(jìn)而提高基因突變檢測(cè)正確度的理論可行性。方法用EGFR T790M突變的人NSCLC細(xì)胞株H1975構(gòu)建裸鼠移植瘤模型36只,自然生長(zhǎng)至不同腫瘤大小后,取血提取cfDNA。設(shè)計(jì)4對(duì)引物,分別擴(kuò)增長(zhǎng)度為81bp、297bp的人LINE-1基因和長(zhǎng)度為120bp、338bp的鼠ACTB基因。用Q-PCR方法分別測(cè)定來(lái)自H1975細(xì)胞的人源ctDNA(以下表示為hctDNA)和來(lái)自裸鼠自身的鼠源cfDNA(以下表示為mcfDNA)的含量,以長(zhǎng)片段hctDNA(或mcfDNA)含量與短片段hct DNA(或mcfDNA)含量比值作為cfDNA的完整性指數(shù)(DII)。同時(shí)用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)EGFR T790M突變,分析突變檢測(cè)結(jié)果與hctDNA含量和腫瘤重量的關(guān)系。此外,分別將順鉑用于體外培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞株和給荷瘤鼠腹腔灌注順鉑,采用上述方法測(cè)定培養(yǎng)基上清和鼠血漿中ctDNA含量,分析化療藥物在體內(nèi)外促進(jìn)ctDNA釋放的規(guī)律。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件。結(jié)果1.36只荷瘤鼠瘤重為0.06g~2.26g,裸鼠血漿中的hctDNA呈偏態(tài)分布,其含量(ng/ml)表示為中值±四分位距(范圍):短片段hctDNA含量6.43±25.93(0.37~186.76),長(zhǎng)片段hctDNA含量0.34±0.95(0.01~25.46),人源DII為0.040±0.044(0.009~0.268)。mcfDNA呈正態(tài)分布,其含量(ng/ml)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(范圍):短片段mcfDNA含量76.71±34.64(6.41~147.44),長(zhǎng)片段mcfDNA含量28.13±12.01(4.72~46.66),鼠源DII為0.397±0.121(0.187~0.736)。無(wú)論是hctDNA還是mcfDNA均以短片段cfDNA含量代表實(shí)際cfDNA含量。hct DNA與mcfDNA含量之比其中值±四分位距(范圍)為0.086±0.406(0.004~3.918)。2.血漿mcfDNA的含量、鼠源DII與腫瘤重量無(wú)關(guān)。血漿hctDNA含量與腫瘤的重量呈正相關(guān),rs=0.85,P0.001;人源DII與腫瘤重量呈負(fù)相關(guān),rs=-0.34,P=0.042。hct DNA與mcfDNA的比值隨腫瘤重量的增加而增大,呈正相關(guān),rs=0.76,P0.001。3.36例樣本中,檢出突變22例,其每毫升血漿突變拷貝數(shù)中值±四分位距(范圍)105.00±231.86(21~4140),未檢出突變14例。22例檢出突變的陽(yáng)性樣本中,其腫瘤重量為0.22g~2.26g,hctDNA含量中值±四分位距(范圍)為18.24±39.23(1.40~186.76),hctDNA與mcfDNA的比值為0.236±0.465(0.039~3.918)。14例未檢出突變的陰性樣本中,其腫瘤重量為0.06g~0.55g,hct DNA含量(ng/ml)范圍2.92±2.91(0.37~16.82),hctDNA與mcfDNA的比值為0.053±0.058(0.004~0.462)。4.突變檢出陽(yáng)性樣本中,每毫升血漿突變拷貝數(shù)與腫瘤重量呈正相關(guān),rs=0.42,P=0.049;同時(shí),每毫升血漿突變拷貝數(shù)也與hct DNA含量呈正相關(guān),rs=0.432,P=0.045。突變檢出陽(yáng)性樣本中其hctDNA含量、腫瘤重量和hctDNA/mcfDNA之比顯著高于突變檢出陰性樣本(P0.05)。hctDNA含量≥6ng/ml者突變檢出率為89.47%,hctDNA6ng/ml者突變檢出率為29.41%。如以腫瘤重量(0.45g)或hctDNA/mcfDNA之比(0.08)為標(biāo)準(zhǔn),兩組突變檢出率都分別為84.21%和35.29%。5.順鉑作用于A549、H520細(xì)胞后,ctDNA在36~48h時(shí)間段內(nèi)釋放量最大,上清液中ctDNA含量達(dá)181~260ng/ml。6.荷A549裸鼠給藥后,其血漿中ct DNA隨給藥時(shí)間而變化,先逐漸上升,峰值出現(xiàn)在給藥后48h,ctDNA含量為416.81±62.25ng/ml,之后下降并趨向于正常水平。結(jié)論1.mcfDNA含量及鼠源DII與腫瘤大小無(wú)關(guān);hctDNA含量與腫瘤大小呈正相關(guān),人源DII與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)。隨著腫瘤增大,hct DNA的含量增加,完整性下降。表明荷瘤鼠血漿中cfDNA來(lái)源于鼠正常細(xì)胞的比較穩(wěn)定,來(lái)自腫瘤細(xì)胞的與腫瘤負(fù)荷呈正比。2.以cfDNA為檢材進(jìn)行突變檢測(cè),突變檢出率與腫瘤大小、hctDNA含量呈正相關(guān),當(dāng)hctDNA含量達(dá)到一定水平時(shí),突變檢測(cè)結(jié)果才可靠。鑒于血漿cfDNA中來(lái)自正常細(xì)胞的部分較為穩(wěn)定,在臨床實(shí)際應(yīng)用中可以考慮用總cfDNA含量代替hct DNA作為突變檢測(cè)的參考指標(biāo)。3.細(xì)胞毒性藥物可以促進(jìn)ctDNA的釋放,在ctDNA釋放高峰時(shí)間點(diǎn)采血可顯著增加血漿ctDNA含量,進(jìn)而提高突變檢測(cè)的可靠性。在臨床實(shí)踐中有望利用這一規(guī)律在患者接受化療后腫瘤細(xì)胞釋放ctDNA的高峰期采血,提高液體活檢的可靠性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2488956