【摘要】：背景和目的:胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率均位于前列,同時(shí)其5年生存率僅為5%-15%。目前的研究認(rèn)為,胃癌的難治性可能與其早期的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是針對上皮細(xì)胞來源的腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn),其本身是機(jī)體生理病理過程的關(guān)鍵部分,當(dāng)EMT發(fā)生時(shí),上皮細(xì)胞則表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的表型,使其具有更高的侵襲性和遷移性。因此,通過研究胃癌細(xì)胞EMT發(fā)生潛在的分子機(jī)制,可能為降低胃癌的早期轉(zhuǎn)移及提高胃癌的預(yù)后提供潛在的依據(jù)。本研究首先在胃癌組織及其對應(yīng)的癌旁正常組織,胃癌不伴有轉(zhuǎn)移組織和胃癌伴有血管或漿膜或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中分別檢測Fbxw7的表達(dá)情況,同時(shí)對胃癌患者Fbxw7的表達(dá)及其臨床病例資料之間的關(guān)系進(jìn)行分析;其次,通過在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)或干擾Fbxw7,然后分別檢測轉(zhuǎn)染前后胃癌的細(xì)胞學(xué)功能及EMT相關(guān)的分子標(biāo)記物的變化;最后,分別在胃癌組織及細(xì)胞中對Fbxw7及RhoA的相關(guān)性進(jìn)行分析,同時(shí)對兩者的相關(guān)性進(jìn)行深入探討并在胃癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Fbxw7及RhoA,然后分別檢測共轉(zhuǎn)染前后胃癌細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)功能及EMT相關(guān)分子標(biāo)記物的變化。方法:(1)通過免疫組化檢測60例胃癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織中Fbxw7的表達(dá)情況,通過WB技術(shù)對20例胃癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織、10例胃癌不伴有轉(zhuǎn)移組織及胃癌伴有血管或漿膜或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織各10例中的Fbxw7的表達(dá)進(jìn)行檢測,同時(shí)對胃癌患者Fbxw7的表達(dá)及其臨床病例資料之間的關(guān)系進(jìn)行分析。(2)通過病毒轉(zhuǎn)染外源性的過表達(dá)或干擾Fbxw7的表達(dá),采用WB,CCK8細(xì)胞增殖,細(xì)胞侵襲遷移,細(xì)胞凋亡,免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法分析胃癌細(xì)胞中Fbxw7表達(dá)水平的變化對胃癌細(xì)胞分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的影響。(3)通過免疫組化、WB技術(shù)及RT-PCR技術(shù)對胃癌組織和細(xì)胞中Fbxw7及RhoA兩者的相關(guān)性進(jìn)行分析,同時(shí)采用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步分析Fbxw7是通過何種分子機(jī)制調(diào)控RhoA的表達(dá)的。采用病毒轉(zhuǎn)染外源性的過表達(dá)或干擾Fbxw7或RhoA表達(dá),通過WB,共轉(zhuǎn)染,CCK8細(xì)胞增殖,細(xì)胞侵襲遷移,細(xì)胞凋亡,免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法,評估Fbxw7表達(dá)水平的高低對胃癌細(xì)胞分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的影響的分子機(jī)制。結(jié)果:(1)Fbxw7在胃癌中為抑癌基因,在胃癌組織中Fbxw7的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織中的表達(dá)。同胃癌伴有血管或漿膜或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織相比較,在胃癌不伴有轉(zhuǎn)移組織中Fbxw7的表達(dá)顯著增高。通過對胃癌患者臨床病例資料分析發(fā)現(xiàn),Fbxw7的表達(dá)水平同腫瘤大小、TNM分期、血管浸潤、漿膜浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),而同患者的年齡、性別及病理類型無關(guān)。通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)Fbxw7同胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。(2)通過外源性基因片段轉(zhuǎn)染過表達(dá)或干擾Fbxw7后發(fā)現(xiàn)Fbxw7的高表達(dá)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡及生長抑制同時(shí)抑制胃癌細(xì)胞的侵襲及遷移,從而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的上游轉(zhuǎn)錄因子Snail 1和ZEB 1而抑制EMT;然而Fbxw7干擾后發(fā)生截然相反的現(xiàn)象。(3)通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Fbxw7同RhoA在蛋白水平呈顯著負(fù)相關(guān),而在mRNA水平則無相關(guān)性,并且通過pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fbxw7高表達(dá)可顯著下調(diào)RhoA及GTP-RhoA的表達(dá)水平。通過免疫共沉淀我們發(fā)現(xiàn)兩者間相互作用的具體機(jī)制為Fbxw7通過泛素化修飾及蛋白水解作用對RhoA的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。最后通過共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fbxw7調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡、生長抑制及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是可以部分通過調(diào)控RhoA信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論:在胃癌中,Fbxw7可以調(diào)控RhoA的表達(dá),而且可以部分通過調(diào)控RhoA信號(hào)通路而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡和生長抑制及抑制胃癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Ya-Chao Hou;Jing-Yu Deng;;Role of E3 ubiquitin ligases in gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2015年03期

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本文編號(hào)：2475264