【摘要】：背景:肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。臨床上肺癌的治療模式主要以手術(shù)切除為主,術(shù)后及無法手術(shù)的患者輔以全身化療、放射治療、新輔助治療及靶向治療為主的綜合治療模式。目前綜合治療對肺癌患者的預(yù)后有了一定的改善,但晚期患者的5年生存率只在5%左右。尋求更好的治療模式是提高肺癌患者預(yù)后的重要方面之一。基因剪接是指在真核細胞中,遺傳信息從DNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄形成mRNA的過程中,去除內(nèi)含子,連接外顯子,再形成具有連續(xù)編碼序列的mRNA分子,即mRNA前體去除內(nèi)含子而保留外顯子的修飾過程。剪接異常就是在mRNA水平,由于各種原因?qū)е掠泄δ艿耐怙@子或者內(nèi)含子發(fā)生了異常而導(dǎo)致翻譯水平不能正常進行,最終形成的蛋白質(zhì)無法行使其相應(yīng)的生物學(xué)功能�；虻募艚赢惓Ｅc腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1,SRSF1)是選擇性剪接因子家族的代表性成員,主要參與前體mRNA的剪接與加工,mRNA的運輸,細胞周期、凋亡的調(diào)控等生理功能。SRSF1在多種腫瘤中表達都上調(diào),少部分學(xué)者認為過表達SRSF1基因抑制肝癌細胞系Bel-7402和SMMC-7721在裸鼠內(nèi)形成腫瘤,促進其RNA在核內(nèi)降解。但多數(shù)報道一致認為,SRSF1是潛在的原癌基因,通過選擇性剪接促進腫瘤的發(fā)展。目前SRSF1在肺癌中的相關(guān)機制尚無明確定論。本課題首先通過生物信息學(xué)分析,篩選與SRSF1有相互作用的基因,并分析這些基因的功能及所參與的信號通路;接著檢測srsf1在肺癌細胞系及組織中的表達,并初步探討srsf1基因與肺癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性;通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)研究srsf1基因?qū)Ψ伟┘毎飳W(xué)行為的影響及可能機制;最后研究肺癌細胞中srsf1基因?qū)鼓[瘤治療敏感性的影響,以期為今后肺癌的治療提供一個新方向。目的:1、檢測srsf1基因在肺癌細胞系和肺癌組織中的表達,并初步探討srsf1基因與肺癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性,以明確srsf1與肺癌的關(guān)系。2、探討srsf1基因?qū)Ψ伟┘毎飳W(xué)行為的影響及可能的機制,為進一步研究奠定基礎(chǔ)。3、研究肺癌細胞中srsf1基因?qū)鼓[瘤治療敏感性的影響,以期為未來肺癌的治療提供一個新方向。方法:1、從cbioportal數(shù)據(jù)庫中篩選與srsf1相關(guān)的基因,選取pearson值0.4的基因,利用string分析,繪出這些基因表達產(chǎn)物的蛋白網(wǎng)絡(luò)圖;利用geneontology分析及keggpathway分析,將這些基因的功能進行歸類。2、在肺癌細胞系中,利用westernblot和q-pcr技術(shù),檢測srsf1蛋白及rna在8種肺癌細胞系及2種支氣管上皮細胞系中的表達;在肺癌組織中,利用westernblot技術(shù)檢測srsf1蛋白在7對肺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達;進一步擴大樣本量,利用免疫組化技術(shù)在60對肺癌組織芯片中檢測srsf1的表達,并初步探討srsf1基因與肺癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。3、構(gòu)建pcdh、srsf1、plko.1、srsf1-sirna1、srsf1-sirna2、srsf1-sirna3六種質(zhì)粒并篩選出穩(wěn)定表達及沉默目的基因的肺癌細胞株。設(shè)計分別帶有相關(guān)酶切位點的上下游引物,用pcr克隆相關(guān)基因全長,瓊脂糖凝膠電泳回收pcr產(chǎn)物,進行酶切、純化、連接并在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化。用相應(yīng)的抗生素對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行菌落pcr陽性克隆鑒定及篩選。從大腸桿菌中提取目的質(zhì)粒,酶切驗證并測序,序列正確的質(zhì)粒檢測蛋白表達正常后用于慢病毒轉(zhuǎn)染。hek293t細胞包裝目的質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒及慢病毒顆粒,收集病毒液上清,感染靶細胞nci-h1299并篩選穩(wěn)定表達的細胞株。用westernblot和q-pcr技術(shù)檢測srsf1基因的表達情況,確定表達正確后,用平板克隆實驗、劃痕愈合實驗、transwell體外遷移及侵襲實驗、細胞凋亡及周期檢測實驗、裸鼠成瘤實驗等,來研究srsf1基因?qū)Ψ伟┘毎飳W(xué)功能的影響,并用westernblot方法探討相關(guān)機制。4、選取pcdh、srsf1、plko.1、srsf1-sirna2四種細胞株,采用化療、熱療、放療及以熱療為基礎(chǔ)的聯(lián)合抗腫瘤治療方式來研究srsf1基因?qū)Ψ伟┘毎鼓[瘤治療的敏感性。通過順鉑(ddp)敏感性實驗,計算出各細胞株對ddp的ic20值和ic50值;利用cck-8實驗、流式細胞術(shù)檢測抗腫瘤治療對肺癌細胞株增殖及凋亡的影響。結(jié)果1、與srsf1相關(guān)的蛋白共2678個,其功能主要富集在細胞周期、dna代謝過程、dna損傷修復(fù)、dna復(fù)制、應(yīng)激、rna剪接等區(qū)域;這些蛋白主要參與了細胞周期、剪接體形成、泛素介導(dǎo)的蛋白降解、rna無義降解、p53、tgf-β等信號通路中。2、srsf1蛋白在nci-h1299,nci-h446,nci-h2170和nci-h520肺癌細胞系中表達增高,其rna在nci-h1299,nci-h446,nci-h358和nci-h520肺癌細胞系中表達增高。srsf1蛋白在7對肺癌組織中表達明顯高于相應(yīng)癌旁組織,其在60對肺癌組織芯片中的陽性表達率為95%,明顯高于相應(yīng)的癌旁肺組織(13.33%),兩者比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.0001)。3、srsf1的表達水平與肺癌腫瘤大小、t分期、n分期及臨床分期呈正相關(guān)(p0.05),而與肺癌患者年齡、性別、病理類型無明顯相關(guān)(p0.05);srsf1陰性或者弱陽性(-/+)表達的患者,其1年、3年、5年生存率分別為93.90%、72.09%、59.30%,srsf1強陽性(++)表達的患者1年、3年、5年生存率分別為64.20%、24.10%、4.02%,兩組比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p0.0001)。4、利用基因重組和小干擾rna技術(shù)構(gòu)建過表達及沉默srsf1基因的nci-h1299肺癌細胞系,用westernblot和q-pcr技術(shù)對srsf1基因過表達及沉默效果進行檢測。結(jié)果表明,在nci-h1299細胞系中過表達srsf1基因后,其蛋白水平及rna水平明顯增加;沉默srsf1的三種sirna序列,其中sirna1和sirna2兩種序列沉默srsf1基因效果較好。5、過表達srsf1基因促進肺癌細胞生長、遷移、侵襲及裸鼠成瘤能力,減少肺癌細胞凋亡,改變細胞周期。平板克隆實驗表明,srsf1組形成的克隆率(63.93%±2.01%)比mock組(43.14%±1.94%)和control組(43.41%±0.85%)增多,結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01);劃痕愈合實驗表明,srsf1組比control組和mock組在6h及16h的劃痕愈合速率均增快(p0.05);transwell體外遷移實驗表明,srsf1組穿過小室的細胞數(shù)目(334.6±18.4)比control組(214.4±17.4)及mock組(217.2±13.8)增多(p0.01);transwell體外侵襲實驗表明,srsf1組侵襲基質(zhì)膠并穿過基底膜的細胞數(shù)目(367.6±17.4)比control組(236.4±13.4)及mock組(251.6±12.6)增多(p0.01);流式細胞儀凋亡檢測結(jié)果顯示,srsf1組凋亡細胞所占比例(2.8%±0.3%)比control組(5.8%±0.7%)減少,但無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);srsf1過表達后改變細胞周期,g0/g1期細胞比例由control組的51.43%±0.21%降到srsf1組的38.05%±4.47%(p0.05),g1/g2期細胞由control組的14.09%±0.38%降到srsf1組的1.32%±0.62%(p0.05),s期細胞由control組的34.49%±0.59%提高到srsf1組的62.0%±4.47%(p0.05);動物實驗表明,srsf1組裸鼠成瘤率(87.50%)高于control組(62.50%),srsf1組裸鼠所形成的腫瘤重量(1650.60±1200mg)重于control組(328.42±249.18mg),結(jié)果又統(tǒng)計學(xué)差異(p0.001)。6、沉默srsf1基因抑制肺癌細胞生長、遷移及侵襲能力。平板克隆實驗結(jié)果顯示,sirna1組(14.21%±0.93%)和sirna2組(26.89%±2.13%)的克隆形成率少于對照組control(53.35%±2.15%)及mock(52.43%±1.83%),結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01);劃痕愈合實驗結(jié)果表明,sirna1組和sirna2組的劃痕愈合速度在6h和20h均比對照組減慢(sirna1組p0.01,sirna2組p0.05);transwell體外遷移實驗顯示,sirna1組(21.4±10.4)和sirna2組(86.2±19.2)穿過小室的細胞數(shù)目比control組(343±18)及mock組(344.4±30.4)減少(p0.001);transwell體外侵襲實驗表明,sirna1組(196.4±20.4)和sirna2組(295.2±21.2)侵襲基質(zhì)膠并穿過基底膜的細胞數(shù)目比control組(508.4±19.4)及mock組(507.4±20.4)明顯減少(p0.01)。7、過表達srsf1基因后,間質(zhì)標志的蛋白n-cadherin、snail表達增加,同時上皮標志的蛋白e-cadherin表達下降;當srsf1基因沉默后,e-cadherin表達增高,而N-cadherin及Snail表達下降。8、過表達SRSF1基因,降低肺癌細胞對抗腫瘤治療的敏感性。順鉑敏感性實驗結(jié)果顯示,SRSF1組的肺癌細胞對順鉑的IC20值為9.21±2.13?g/ml,IC50值為24.82±4.02?g/ml,高于pCDH組的IC20值(6.71±3.16?g/ml)和IC50值(14.09±2.76?g/ml),兩者比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。CCK-8實驗表明,抗腫瘤治療對SRSF1組細胞的增殖抑制作用弱于pCDH組;熱療聯(lián)合化療或者放療比單一治療更能抑制細胞增殖。流式細胞儀凋亡檢測實驗證實,抗腫瘤治療后SRSF1組細胞凋亡比例少于pCDH組,放療組及聯(lián)合治療組有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);熱療聯(lián)合化療或放療比單一治療增加了細胞的凋亡比例。9、沉默SRSF1基因,增加肺癌細胞對抗腫瘤治療的敏感性。siSRSF1組的肺癌細胞對順鉑的IC20值為2.88±1.23?g/ml,IC50值為6.62±1.15?g/ml,低于pLKO.1組的IC20值(6.13±2.47?g/ml)和IC50值(13.90±2.30?g/ml),兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。CCK-8實驗表明,抗腫瘤治療對siSRSF1組細胞的增殖抑制作用強于pLKO.1組;熱療聯(lián)合化療或者放療比單一治療更能抑制細胞增殖。流式細胞儀凋亡檢測實驗表明,抗腫瘤治療后si SRSF1組細胞凋亡比例明顯多于pLKO.1組,各組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);熱療聯(lián)合化療或者放療比單一治療增加了細胞的凋亡比例。結(jié)論1、SRSF1在肺癌中表達增高,并與肺癌的生長及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。2、SRSF1基因高表達是影響肺癌患者預(yù)后的重要危險因素,有可能成為肺癌評價預(yù)后及監(jiān)測療效的指標之一。3、SRSF1基因促進肺癌細胞的惡性生物學(xué)行為。4、SRSF1基因可能通過正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達來調(diào)控肺癌細胞EMT的發(fā)生。5、SRSF1基因的表達水平與肺癌細胞抗腫瘤治療的敏感性呈負相關(guān)。6、熱療可以增加肺癌細胞對化療及放療的敏感性。7、下調(diào)SRSF1基因有望為肺癌的治療提供新的方向和新的靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2475155