【摘要】：研究背景原發(fā)性肝癌是來源肝臟上皮組織的惡性腫瘤,是全球第五位最常見的癌癥和第三位最常見的癌癥死因,全世界每年約有63萬肝癌新發(fā)病例而超過半數(shù)的新病例發(fā)生在中國[1],目前,外科切除和肝移植仍是最有效治療早期階段肝癌的方法,盡管如此,患者五年內(nèi)手術(shù)部位復發(fā)率高達70%[2],而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導致患者預后差的主要原因。嚴格的手術(shù)指征,肝臟捐贈者的限制和高昂的成本造成肝移植只適用于少數(shù)患者。近年來,隨著高通量、高分辨的成像及實驗技術(shù)的發(fā)展,長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA lnc RNA)與疾病發(fā)生發(fā)展機制的密切相關性逐漸顯現(xiàn),尤其是lnc RNA對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡等生物學行為的調(diào)控效應備受關注[3-5]。lnc RNA廣泛存在于真核生物的細胞核與細胞質(zhì)中,一般長度為200bp-100kb,缺乏開放式閱讀框,不能編碼蛋白質(zhì),起初甚至被認為是“轉(zhuǎn)錄噪音”[6-8],近年來,對lnc RNA的研究逐漸取得進展,有越來越多的證據(jù)表明lnc RNA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關。前期實驗我們采用基因芯片技術(shù)在肝癌組織中篩選出一個肝癌相關新基因名為UC00lkfo,其長度為2043bp,基因編碼區(qū)與α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actinα-SMA)的編碼基因ACTA2發(fā)生部分重疊,應用基因組瀏覽器和RNAplex預測ACTA2為UC001kfo的靶基因,進一步研究發(fā)現(xiàn)UC001 kfo和α-SMA在肝癌組織較癌周組織中表達顯著性升高,并且在不同侵襲能力肝癌細胞中的表達量不同。后在人肝癌組織及細胞模型的基礎上利用RT-PCR、原位雜交、免疫組化和細胞侵襲等實驗進一步證明UC001kfo是具有調(diào)節(jié)功能的長鏈非編碼RNA,能夠促進肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移�？傊�,前期實驗表明UC001kfo的靶基因為ACTA2,靶蛋白為α-SAM,UC001kfo與肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關。為了更進一步分析UC001kfo與α-SAM的相互作用機制,我們已經(jīng)采用si RNA干擾技術(shù)下調(diào)UC001kfo的表達,RT-PCR的方法檢測了α-SAM的m RNA表達,采用Western Blot的方法檢測了α-SAM的蛋白表達,結(jié)果兩者顯著相關,從m RNA和蛋白水平分別驗證下調(diào)UC001kfo后α-SAM的表達減少[9].α-SMA是肌動蛋白的一種,后者以單體和多聚體形式存在。單體的肌動蛋白即球狀肌動蛋白(globular actin,G-actin)。肌動蛋白的多聚體形成肌動蛋白絲即纖維狀肌動蛋白(fibros actin,F-actin),肌動蛋白至少表達成6種異構(gòu)形式,根據(jù)等電點的不同,將其分為分為α、β、γ三類,α分布于各種肌肉細胞中,其中α-平滑肌肌動蛋白參與細胞形態(tài)的維持,參與構(gòu)成真核細胞的微絲結(jié)構(gòu),是構(gòu)成細胞骨架和收縮構(gòu)件的主要成分,肌動蛋白的聚合和解聚參與細胞骨架的重塑,影響細胞運動,因此,α-SMA是調(diào)節(jié)細胞運動的基礎[10]。另外,a-SMA是肝癌相關肌纖維母細胞(carcinoma-associated fibroblasts CAF)的重要細胞成分,在肝癌細胞旁分泌機制作用下,癌旁組織成纖維細胞(paired peritumoral tissue fibroblasts PTF)表達a-SMA向CAF表型分化,結(jié)果PTF發(fā)生遷移和侵襲[11]。研究表明a-SMA、鈣黏蛋白、波形蛋白的表達還可促使上皮細胞-間充質(zhì)(epithelialmesenchymal transition,EMT)改變[12],而EMT能夠通過特定程序?qū)⑸掀ぜ毎D(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細胞,如使細胞失去極性、獲得較高的降解細胞外基質(zhì)的能力等,EMT主要參與生長發(fā)育、損傷修復、腫瘤轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過程[13],以細胞黏附分子表達的減少,細胞骨架中波形蛋白(Vimentin)、平滑肌蛋白表達增加以及形態(tài)上具有間充質(zhì)細胞的特征等為主要特點[14-15],是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移能力的重要生物學過程[16-17]�？傊�,α-SAM通過細胞骨架重塑,構(gòu)成微絲和EMT的發(fā)生影響細胞遷移,是增強肝癌細胞運動能力的關鍵環(huán)節(jié),在肝癌細胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。近年來,研究者對細胞核骨架的研究取得很大進展,成為細胞生物學研究的一個新的生長點,細胞核骨架是相對于細胞質(zhì)骨架而言,兩者共同構(gòu)成細胞骨架,核骨架與DNA的復制、RNA的轉(zhuǎn)錄和加工、染色體的組裝密切相關。肌動蛋白存在于細胞核中已被證明,可能的原因之一是由胞質(zhì)肌動蛋白轉(zhuǎn)運至細胞核,雖然肌動蛋白是眾所周知的在細胞骨架的動態(tài)行為中發(fā)揮職能,但新興的研究在強調(diào)肌動蛋白的新角色,一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌動蛋白在細胞核活動中的功能,肌動蛋白作為核部件之一,有它自己的結(jié)構(gòu)和功能的規(guī)則,比如與核基質(zhì),染色質(zhì)重塑,轉(zhuǎn)錄和m RNA加工相關[18]。因此,α-SAM似乎參與核轉(zhuǎn)錄調(diào)控,可能對細胞增殖產(chǎn)生影響。本次研究采用過表達和si RNA干擾技術(shù)通過UC001kfo調(diào)控α-SMA的表達,使細胞骨架形態(tài)發(fā)生改變,促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)移,同時使肝癌細胞發(fā)生EMT;研究UC001kfo對肝癌細胞增殖和凋亡的調(diào)控效應。目的1.采用lnc RNA過表達和si RNA干擾技術(shù)通過UC001kfo調(diào)控α-SMA的表達,使細胞骨架形態(tài)發(fā)生改變,探討該基因?qū)Ω伟┘毎忠u轉(zhuǎn)移的影響。2.探討UC001kfo對肝癌細胞增殖的影響。3.探討UC001kfo對肝癌細胞凋亡的影響。方法以肝癌細胞株Hep G2為細胞模型,在37℃5%CO2滅菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng),適時傳代;實驗分組為上調(diào)實驗:p CDNA3.1-UC001kfo(實驗組)、p CDNA3.1(陰性對照組)、Hep G2(空白組);下調(diào)實驗:UC001kfo-si RNA(實驗組)、NC-si RNA(陰性對照組)、Hep G2(空白組),每組三個復孔;p CDNA3.1-UC001kfo載體前期實驗已構(gòu)建;采用脂質(zhì)體(參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染后進行如下實驗:熒光拍照檢測NC-siRNA-FAM的轉(zhuǎn)染;RT-qpCR檢測UC001kfo和α-SMA的表達;免疫組化檢測細胞骨架的變化;Transwell小室實驗,細胞劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力;MTT和細胞克隆形成實驗檢測對細胞增殖能力的影響;流式細胞術(shù)檢測對細胞凋亡的影響。統(tǒng)計學方法應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用均值±標準差(x±s)表示,兩組定量資料比較采用t檢驗。以α=0.05為檢驗水準。結(jié)果1 RT-q PCR檢測UC001kfo和SMA的表達量(1)UC001kfo:48h后UC001kfo表達量UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為1924.14±238.69、1.87±0.43、1.00±0.29、0.01±0.00、0.85±0.25。(2)α-SMA:48h后α-SMA表達量UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為6.81±1.39、0.82±0.14、1.00±0.54、0.59±0.04、1.47±0.15。T-test結(jié)果:上調(diào)實驗(1)UC001kfo:48h后UC001kfo表達量UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。(2)α-SMA:48h后α-SMA表達量UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。下調(diào)實驗(1)UC001kfo:h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)(2)α-SMA:UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。2免疫組化IA值48h UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為972.53±59.10、623.11±57.66、697.98±51.29、399.03±64.47、633.94±44.44。T-test結(jié)果:上調(diào)實驗:UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01);下調(diào)實驗:UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01)。3 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力的變化轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為213±16.17、96±4.58、128±3.21、28±9.64、80±4.04;轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為201±19.09、97±5.69、116±11.53、40±3.79、72±10.21。T-test結(jié)果:上調(diào)實驗:轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-p CDNA組分別與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01);轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-p CDNA組分別與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01)。下調(diào)實驗:轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-si RNA組分別與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01);轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-si RNA組分別與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01)。4細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化轉(zhuǎn)染48h后距劃痕24h:遷移率(%)UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為32.56±5.56、31.05±7.12、35.77±7.28、25.72±5.13、32.59±3.74;距劃痕48h:UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為63.57±5.58、63.41±6.04、56.77±7.54、40.76±4.74、54.76±0.57;距劃痕72h:UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-si RNA組分別為98.34±2.88、87.90±0.83、92.43±2.19、、60.98±1.41、80.34±1.05。T-test結(jié)果:上調(diào)實驗:轉(zhuǎn)染48h后距劃痕24h UC001kfo-p CDNA組分別與Hep G2組和p CDNA組比較均無統(tǒng)計學意義(均P0.05);距劃痕48h UC001kfo-p CDNA組與Hep G2組和p CDNA組比較均無統(tǒng)計學意義(均P0.05);距劃痕72h UC001kfo-p CDNA組與Hep G2組和p CDNA組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。下調(diào)實驗:距劃痕24h UC001kfo-si RNA組分別與Hep G2組和NC-si RNA組比較均無統(tǒng)計學意義(均P0.05);距劃痕48h UC001kfo-si RNA組與Hep G2組和NC-si RNA組比較均有統(tǒng)計學意義(均P0.05);距劃痕72h UC001kfo-si RNA組與Hep G2組和NC-si RNA組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。5 MTT和克隆形成實驗檢測細胞增殖能力的變化1.MTT法檢測結(jié)果顯示:24h時pcDNA3.1-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為0.72±0.02、0.67±0.04、0.71±0.02、0.56±0.04、0.7±0.02;48h時p CDNA-UC001kfo組、Hep G2組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為1.22±0.07、1.03±0.03、1.09±0.04、0.8±0.03、0.97±0.07;96h時p CDNA-UC001kfo組、Hep G2組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為1.63±0.07、1.39±0.07、1.47±0.03、1.05±0.04、1.38±0.02。T-test結(jié)果:上調(diào)實驗:24h UC001kfo-p CDNA組分別與Hep G2組和p CDNA組比較均無統(tǒng)計學意義(均P0.05);48h時UC001kfo-p CDNA組與p CDNA比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),UC001kfo-p CDNA組與Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01);96h時UC001kfo-p CDNA組與p CDNA比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);UC001kfo-p CDNA組與Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01);下調(diào)實驗:24h UC001kfo-si RNA組分別與Hep G2組和NC-si RNA組比較均無統(tǒng)計學意義(均P0.05);48h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);UC001kfo-si RNA組與Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)。96h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01)。2.平板克隆形成實驗結(jié)果顯示:48h時克隆集落形成率(%)p CDNAUC001kfo組、Hep G2組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為34.94±4.24、25.73±2.32、26.80±1.91、13.20±0.92、24.40±2.31;96h時p CDNA-UC001kfo組、Hep G2組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為40.93±4.41、30.40±5.14、25.80±3.67、13.60±1.83、22.73±1.62。T-test結(jié)果:上調(diào)實驗:48h時UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。96h時UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01);下調(diào)實驗:48h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01);96h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均P0.01)。6流式細胞儀檢測凋亡變化轉(zhuǎn)染48h后Hep G2組、p CDNA-UC001kfo組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為3.5±2.36、6.3±1.15、3.7±2.76、3.83±2.46、3.53±2.28,轉(zhuǎn)染96h后Hep G2組、p CDNA-UC001kfo組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為3.12±0.58、4.97±1.16、4.03±1.04、2.3±0.56、3.6±1.78。T-test結(jié)果:上調(diào)實驗:48h、96h p CDNA-UC001kfo組分別與p CDNA組、Hep G2組比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P0.05);下調(diào)實驗:48h、96h p CDNA-si RNA組分別與si RNA組、Hep G2組比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P0.05)。結(jié)論1.UC001kfo通過調(diào)控a-SMA促進肝癌細胞偽足形成,細胞骨架增多,更易于肝癌細胞的運動,進而促進侵襲轉(zhuǎn)移,同時發(fā)生上皮-間質(zhì)改變。2.UC001kfo促進肝癌細胞的增殖。3.UC001kfo未參與肝癌細胞凋亡的調(diào)控。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【二級參考文獻】

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1 王萍;楊金鳳;張慶;承澤農(nóng);于東紅;;RhoC基因的過量表達在胃癌中的意義[J];臨床消化病雜志;2007年02期

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本文編號：2462156