【摘要】：肝癌主要指肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是我國常見的惡性腫瘤之一,它具有惡性度高、侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展快、預(yù)后差和死亡率高等特點(diǎn)。細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP)是一類位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白超家族,參與多種內(nèi)源性物質(zhì)和外源性化合物的代謝。亞硝胺類、黃曲霉毒素、煙草和酒精等已被證實(shí)為肝癌風(fēng)險(xiǎn)因素,這些致癌物質(zhì)在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化代謝均有CYP酶參與。因此,深入研究CYP酶活性與肝癌的相關(guān)性是當(dāng)今世界研究的重要課題。為了考察肝癌病人藥物代謝的變化,支持臨床合理用藥,本課題以102例HCC病人非腫瘤肝組織為研究對(duì)象,105例正常非腫瘤肝組織為對(duì)照,系統(tǒng)地了考察了10種主要CYP酶(CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5)對(duì)探針?biāo)幬锏捏w外代謝活性;測定了肝微粒體蛋白含量;分析了肝纖維化程度和基因多態(tài)性對(duì)CYP酶活性的影響,以期發(fā)現(xiàn)肝癌病人藥物代謝的個(gè)體差異及影響因素,為臨床個(gè)體化用藥提供理論依據(jù)。方法1.倫理學(xué)聲明本研究方案經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),受試者均已簽署知情同意書。2.肝臟標(biāo)本本研究收集的人肝標(biāo)本均為常規(guī)手術(shù)切除的非腫瘤肝臟組織,標(biāo)本來自河南省人民醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院。102例HCC病人,伴有HBV或HCV感染,肝標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)伴有肝硬化或肝纖維化病變。105例對(duì)照組肝標(biāo)本來自肝血管瘤、肝轉(zhuǎn)移癌、膽石癥和膽囊癌病人,肝功能正常,無HBV或HCV感染,經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)肝標(biāo)本為正常肝組織。所有肝標(biāo)本在手術(shù)切除后經(jīng)常規(guī)處理,于30分鐘內(nèi)置于液氮以備后期使用。HCC組中男性86例、女性16例,年齡范圍29歲~75歲(53±11歲),吸煙者45例(占44.1%),飲酒者37例(占36.3%)。對(duì)照組中男性37例、女性68例,年齡范圍20歲~75歲(48±10歲),吸煙者12例(占11.9%),飲酒者12例(占11.9%)。受試者均常規(guī)使用麻醉藥,用藥史顯示近期未使用CYP酶誘導(dǎo)劑或抑制劑。肝組織經(jīng)過固定、包埋、HE和Masson染色,根據(jù)Scheuer分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),按纖維化程度分為S1~S4期。其中,S1~S3期病變程度較輕,為肝纖維化;S4期病變程度較重為肝硬化。3.肝微粒體制備及蛋白測定采用低溫差速離心法制備人肝微粒體(human liver microsomes,HLMs);肝微粒體蛋白濃度采用Bradford法測定;一氧化碳差示法測定總CYP含量和細(xì)胞色素b5(cytochrome b5,Cyt b5)含量;根據(jù)細(xì)胞色素c電子受體測定NADPH-P450還原酶(POR)活性;肝臟回收率為相同個(gè)體的肝微粒體POR活性與肝勻漿POR活性之比;每克肝臟的微粒體蛋白含量(value of microsomal protein per gram of liver,MPPGL)以肝微粒體濃度×體積/肝標(biāo)本凈重/肝臟回收率計(jì)算得到。4.基因分型本研究檢測了在中國人群中發(fā)生頻率超過1%的多態(tài)性位點(diǎn),包括CYP酶的24個(gè)突變位點(diǎn)、以及POR的16個(gè)突變位點(diǎn)。其中CYP2E1*1C*1D基因型采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的一步PCR方法,通過測定產(chǎn)物片段長度確定。其余基因突變位點(diǎn)均采用質(zhì)譜方法檢測,通過檢測兩個(gè)不同突變所引起的單堿基延伸產(chǎn)物分子量的差異確定。5.10種CYP酶對(duì)探針底物的代謝活性采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)-紫外法(UV)或熒光法(FLD)測定探針底物的代謝產(chǎn)物濃度。非那西丁、香豆素、安非他酮、紫杉醇、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪達(dá)唑侖分別作為CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的體外探針,底物的生物轉(zhuǎn)化程度(TR)作為反應(yīng)速度,Graph Pad Prism 5.0軟件計(jì)算米氏常數(shù)(K m)和最大反應(yīng)速度(V max),體外代謝內(nèi)在清除率(CL int)由V max/K m比值得到。所建立的藥物測定方法均在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r0.999);日內(nèi)、日間變異均15%;相對(duì)回收率均在85%~115%之間;底物穩(wěn)定性良好,所建立的分析方法符合生物樣本的測定要求。探針底物范圍如下:非那西丁6.25~800μM,香豆素0.156~20μM,安非他酮7.8~500μM,紫杉醇2.5~80μM,甲苯磺丁脲31.25~2000μM,奧美拉唑3.9~500μM,右美沙芬2.5~640μM,氯唑沙宗7.8~500μM,咪達(dá)唑侖0.39~50μM。體系微粒體蛋白濃度為:CYP1A2、CYP2A6和CYP2E1均為0.3 mg·ml-1;CYP2D6和CYP3A4/5為0.2 mg·ml-1;CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19為0.5 mg·ml-1。預(yù)孵育時(shí)間均為37°C水浴5 min,孵育時(shí)間為CYP1A2、CYP2A6和CYP2E1均為30 min;CYP2B6和CYP2C9為60 min;CYP2C19為90 min;CYP2C8為120 min;CYP2D6為20 min;CYP3A4/5為5 min。孵育結(jié)束時(shí)加入20μl冰乙腈或10μl高氯酸沉淀或1 ml乙酸乙酯萃取終止反應(yīng)。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果表明,人肝微粒體代謝底物的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)呈非正態(tài)分布,故采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。SPSS17.0對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間參數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn),兩組間等位基因分布比較采用卡方檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。結(jié)果1.肝臟標(biāo)本的組織病理分級(jí)102例HCC肝標(biāo)本中,S1~S4期分別有8、19、27、48例;其中有54例為肝纖維化(S1、S2、S3),48例為肝硬化(S4)。2.肝微粒體蛋白含量結(jié)果顯示,102例HCC肝微粒體的總CYP含量、細(xì)胞色素b5含量、MPPGL的中位數(shù)(范圍)分別為134.0(33.5~468.9)pmol·mg-1、293.2(109.7~506.3)pmol·mg-1和28.9(7.7~93.6)mg·g-1,POR活性為44.6(17.8~74.3)pmol·min-1·mg-1。與對(duì)照組相比,HCC肝微粒體總CYP含量、MPPGL、POR活性均顯著性降低。3.10種CYP酶的代謝活性3.1肝微粒體水平的酶活性以每毫克肝微粒體蛋白為單位,CYP酶對(duì)探針底物的清除率代表肝微粒體水平的酶活性。HCC病人10種CYP的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(K m、V max和CL int)中位數(shù)(范圍)分別為:CYP1A2為70.0(33.2~687.8)μM、521.5(68.6~2605.0)pmol·min-1·mg-1及7.8(0.29~42.8)μl·min-1·mg-1,個(gè)體差異為20~147倍。CYP2A6為3.6(0.58~17.6)μM、522.8(0.73~2880.0)pmol·min-1·mg-1及145.4(0.26~260.0)μl·min-1·mg-1,個(gè)體差異為30~3945倍。CYP2B6為108.7(46.9~1198.0)μM、78.0(15.0~237.9)pmol·min-1·mg-1及0.71(0.049~4.5)μl·min-1·mg-1,個(gè)體差異為15~91倍。CYP2C8為23.4(9.5~235.5)μM、13.5(4.7~112.3)pmol·min-1·mg-1及0.63(0.035~4.0)μl·min-1·mg-1,個(gè)體差異為23~114倍。CYP2C9為204.6(60.1~773.1)μM、319.1(61.9~903.2)pmol·min-1·mg-1及1.5(0.08~4.5)μl·min-1·mg-1,個(gè)體差異為12~56倍。CYP2C19為71.6(28.8~275.5)μM、101.8(21.5~268.4)pmol·min-1·mg-1及1.4(0.22~3.9)μl·min-1·mg-1,個(gè)體差異為9~17倍。CYP2D6為30.7(7.8~273.5)μM、172.4(37.8~560.4)pmol·min-1·mg-1及6.9(0.49~54.7)μl·min-1·mg-1,個(gè)體差異為14~111倍。CYP2E1為60.3(24.3~91.3)μM、1238.0(151.0~4858.0)pmol·min-1·mg-1及20.9(4.1~53.2)μl·min-1·mg-1,個(gè)體差異為3~32倍。CYP3A4/5為2.6(1.1~8.0)μM、1205.5(332.4~4602.0)pmol·min-1·mg-1及524.8(73.8~1099.8)μl·min-1·mg-1,個(gè)體差異為7~14倍。與對(duì)照組相比,對(duì)于K m,HCC組中CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19、CYP2E1和CYP3A4/5的K m均明顯升高。對(duì)于V max,CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的值均升高,其中CYP2E1的V max增加了2.3倍;CYP1A2和CYP2C8的V max顯著下降。對(duì)于CL int,CYP2C9、CYP2D6和CYP2E1的值顯著升高、CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19的CL int降低。其中CYP2C8的CL int下降尤為顯著,比對(duì)照組降低了77%。3.2肝組織水平的酶活性以每克肝臟為單位,CYP酶對(duì)探針的清除率代表肝組織水平的酶活性。根據(jù)肝組織的MPPGL含量,由微粒體水平酶活性推導(dǎo)出肝組織水平的酶活性。HCC組10種CYP酶的V max和CL int中位數(shù)(范圍)分別為:CYP1A2為13551.5(1110.7~158520.7)pmol·min-1·g-1及199.6(13.5~2436.9)μl·min-1·g-1。CYP2A6為14988.9(18.4~114723.7)pmol·min-1·g-1及3760.4(8.2~13285.9)μl·min-1·g-1。CYP2B6為2159.1(286.6~14008.3)pmol·min-1·g-1及19.7(0.63~98.9)μl·min-1·g-1。CYP2C8為408.4(63.0~2915.4)pmol·min-1·g-1及17.4(0.80~149.4)μl·min-1·g-1。CYP2C9為9037.1(816.2~37935.6)pmol·min-1·g-1及43.6(3.0~178.9)μl·min-1·g-1。CYP2C19為2816.3(260.3~11678.2)pmol·min-1·g-1及39.1(1.7~127.3)μl·min-1·g-1。CYP2D6為5300.4(332.3~28727.7)pmol·min-1·g-1及191.0(4.6~1711.0)μl·min-1·g-1。CYP2E1為34690.2(1155.1~113794.2)pmol·min-1·g-1及604.6(31.1~2024.8)μl·min-1·g-1。CYP3A4/5為31264.6(2666.7~143812.5)pmol·min-1·g-1及14644.2(1167.6~51938.0)μl·min-1·g-1。HCC組與對(duì)照組相比,對(duì)于V max,CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19的V max均降低,CYP2E1的V max升高。對(duì)于Cl int,CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19和CYP3A4/5的Cl int均比對(duì)照組降低,CYP2E1的Cl int增加。3.3 CYP水平的酶活性以每pmol CYP亞型為單位,CYP酶對(duì)探針的清除率代表CYP水平的酶活性。根據(jù)肝臟微粒體總CYP含量,由微粒體水平活性推導(dǎo)出CYP水平的酶活性。HCC組10種CYP酶的V max和CL int中位數(shù)(范圍)分別為:CYP1A2為3.9(0.30~31.3)pmol·min-1·pmol-1及0.06(0.002~0.52)μl·min-1·pmol-1。CYP2A6為3.7(0.004~43.0)pmol·min-1·pmol-1及0.90(0.002~4.2)μl·min-1·pmol-1。CYP2B6為0.58(0.03~3.3)pmol·min-1·pmol-1及0.005(0.0003~0.03)μl·min-1·pmol-1。CYP2C8為0.10(0.02~0.83)pmol·min-1·pmol-1及0.005(0.0001~0.04)μl·min-1·pmol-1。CYP2C9為2.3(0.33~12.5)pmol·min-1·pmol-1及0.01(0.001~0.08)μl·min-1·pmol-1。CYP2C19為0.62(0.046~3.6)pmol·min-1·pmol-1及0.0099(0.00099~0.05)μl·min-1·pmol-1。CYP2D6為1.2(0.14~7.7)pmol·min-1·pmol-1及0.044(0.001~0.49)μl·min-1·pmol-1。CYP2E1為8.3(1.1~48.4)pmol·min-1·pmol-1及0.15(0.023~0.67)μl·min-1·pmol-1。CYP3A4/5為9.1(1.1~57.6)pmol·min-1·pmol-1及3.5(0.49~13.5)μl·min-1·pmol-1。與對(duì)照組相比,HCC組中CYP2C8的V max顯著降低,CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的V max均升高。對(duì)于CL int,CYP1A2和CYP2C8的V max均降低,CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的CL int均升高。4.CYP等位基因頻率的分布對(duì)比HCC組和對(duì)照組,CYP2D6*10(100CT)等位基因頻率分布存在顯著性差異。CYP2D6*10突變純合子TT在HCC組的頻率明顯降低(16.7%vs.46.7%,P0.01),而雜合子CT頻率顯著增加(46.9%vs.21.9%,P0.01)。在HCC組內(nèi)等位基因頻率高低依照CTCCTT排次,而在對(duì)照組則相反,為TTCCCT。兩個(gè)亞組(纖維化組和肝硬化組)分別與對(duì)照組相比,CYP2D6*10等位基因分布也存在顯著差異。在纖維化組和肝硬化組中突變純合子TT頻率均比對(duì)照組顯著降低,而雜合子CT頻率顯著升高。纖維化組與肝硬化組相比,CYP2D6*10等位基因頻率存在顯著差異,肝硬化組中突變純合子TT頻率比纖維化組顯著降低(8.9%vs.23.9%,P0.01)。5.CYP基因多態(tài)性對(duì)酶活性的影響結(jié)果顯示在HCC組中,4種CYP基因多態(tài)性對(duì)酶活性產(chǎn)生影響。對(duì)于K m,CYP2D6*10(100CT)的突變純合子TT(125.1μM)、雜合子CT(30.4μM)分別與野生型CC(17.4μM)相比,K m均顯著升高。V max的趨勢與K m相反,TT(89.4 pmol·min-1·mg-1)及CT(155.6 pmol·min-1·mg-1)攜帶者均顯著低于CC攜帶者的V max(241.5 pmol·min-1·mg-1)。對(duì)于CL int,TT(0.70μl·min-1·mg-1)、CT(6.9μl·min-1·mg-1)與CC(13.2μl·min-1·mg-1)相比,CL int均明顯降低,其中較為顯著的變化是TT攜帶者與CC攜帶者相比CL int降低了95%。CYP3A5*3突變純合子*3*3的K m(2.3μM)、雜合子*1*3的K m(2.8μM)與野生型*1*1(3.9μM)相比,均顯著降低。V max顯示出與K m相同的趨勢(*3*3*1*3*1*1)。對(duì)于CL int,*3*3(490.8μl·min-1·mg-1)、*1*3(542.0μl·min-1·mg-1)與*1*1(762.9μl·min-1·mg-1)相比,CL int均顯著性降低。在HCC病人中未檢測到CYP2C9*3突變純合子*3*3基因型。雜合子*1*3比野生型*1*1的V max顯著性降低(223.2 vs.326.5 pmol·min-1·mg-1,P0.01)。同時(shí),*1*3攜帶者(1.1μl·min-1·mg-1)比*1*1攜帶者的CL int(1.6μl·min-1·mg-1)顯著降低(P0.05)。CYP2B6(516GT)突變純合子TT的CL int和V max均低于野生型GG的CL int和V max。在對(duì)照組中,CYP2D6*10、CYP3A5*3及CYP2C9*3等三種基因突變對(duì)酶活性的影響較為顯著,均引起CYP酶活性下降。HCC組與對(duì)照組相比,基因多態(tài)性對(duì)酶活性的影響基本一致,即CYP2D6*10、CYP3A5*3及CYP2C9*3等三種突變對(duì)酶活性具有顯著的影響,突變均導(dǎo)致CYP酶代謝能力下降。6.POR基因多態(tài)性對(duì)CYP酶活性的影響以CL int代表CYP酶活性,在HCC組中POR基因多態(tài)性對(duì)CYP1A2、CYP2A6、CYP2C8、CYP2D6和CYP2E1活性具有影響作用。POR(rs10954732)雜合子GA與野生型GG相比,CYP2E1的CL int降低。POR(rs2286823)對(duì)CYP2E1有類似的影響,雜合子GA與野生型GG相比,CYP2E1的CL int降低。此外,POR(rs4732516)雜合子CG與野生型CC相比,CYP2D6的CL int更高,同時(shí),突變純合子GG與CG相比,CL int顯著下降。POR(rs1057870)雜合子GA與野生型GG相比,CYP1A2的CL int升高。在對(duì)照組,POR基因突變對(duì)CYP2B6、CYP2C8、CYP2E1活性產(chǎn)生影響。POR(rs1057868)雜合子CT比野生型CC的CYP2B6和CYP2C8的CL int更低;POR(rs3823884)雜合子AC比野生型AA的CYP2E1活性下降;POR(rs2286823)雜合子CT、突變純合子TT均比野生型CC的CYP2E1活性降低。HCC組和對(duì)照組相比較,POR的基因多態(tài)性均對(duì)CYP2C8和CYP2E1活性產(chǎn)生影響;但在HCC組有更多的CYP同工酶(CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6)活性受到POR基因多態(tài)性影響。7.肝組織纖維化程度對(duì)CYP酶活性的影響組織病理學(xué)結(jié)果顯示,HCC病人的肝組織伴有肝纖維化或肝硬化病變。為了分析病變程度對(duì)CYP酶活性的影響,分別測定纖維化和肝硬化兩個(gè)亞組的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(K m、V max和CL int)。與纖維化組相比,肝硬化組CYP2C8的K m升高、CYP2D6的K m降低。對(duì)于CL int,CYP2D6的CL int在兩組之間存在差異,肝硬化組比纖維化組的CYP2D6CL int升高了53.6%(8.4 vs.3.9μl·min-1·mg-1,P0.05)。與正常對(duì)照組相比,對(duì)于K m,纖維化組和肝硬化組中CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19、CYP2E1和CYP3A4/5的K m均升高;CYP2D6的K m在肝硬化組降低(21.4 vs.28.9μM,P0.05)但在纖維化組無改變。對(duì)于V max,纖維化組和肝硬化組中CYP1A2和CYP2C8的值降低;CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的值均升高。對(duì)于CL int,纖維化組和肝硬化組中CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19的CL int均降低;CYP2C9和CYP2E1的CL int均升高。不同的是,肝硬化組中CYP2D6的CL int比對(duì)照組升高(8.4 vs.3.5μl·min-1·mg-1,P0.05),但纖維化組中CYP2D6的CL int無改變。8.人口學(xué)因素對(duì)CYP酶活性的影響以CL int代表CYP酶活性,分析了性別、吸煙、飲酒等因素對(duì)CYP酶活性的影響。在HCC組中,女性的CYP2A6活性比男性增加(164.1 vs.142.1μl·min-1·mg-1,P0.05);與吸煙者相比,不吸煙者具有較高的CYP2D6活性(9.0vs.5.3μl·min-1·mg-1,P0.05);不飲酒者相對(duì)飲酒者,CYP2D6的活性明顯升高(8.5 vs.5.0μl·min-1·mg-1,P0.05)。在對(duì)照組中,不吸煙者與吸煙者相比,CYP2D6的CL int降低(3.0 vs.5.7μl·min-1·mg-1,P0.05)。HCC組與對(duì)照組相比,吸煙對(duì)兩組的影響存在顯著差異。吸煙的HCC病人比不吸煙者具有更低的CYP2D6活性,而在正常對(duì)照組中吸煙者具有較高的CYP2D6活性;性別和飲酒能夠引起HCC病人CYP酶活性變化,但對(duì)正常對(duì)照組無顯著影響。結(jié)論1.肝癌病人CYP酶的活性受到疾病影響而顯著改變,CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19活性降低,CYP2C9、CYP2D6和CYP2E1活性增加,CYP2A6、CYP2B6和CYP3A4/5活性無改變,且酶活性存在較大的個(gè)體差異。2.肝癌病人CYP2D6*10(100CT)等位基因分布顯著改變,突變純合子TT頻率降低,雜合子CT頻率增加。3.肝癌病人肝微粒體蛋白含量顯著降低,肝組織水平酶活性顯著變化。4.CYP2D6*10、CYP2C9*3和CYP3A5*3等三種基因多態(tài)性對(duì)肝癌病人酶活性有顯著的影響,基因突變引起酶活性降低。5.肝癌病人的肝組織硬化影響CYP2D6的活性而使其顯著升高。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
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本文編號(hào)：2462021