【摘要】：目的探討整合素α1(ITGA1)在結(jié)直腸腺瘤癌組織、血清及5系結(jié)直腸腫瘤細胞株中的表達情況;構(gòu)建ITGA1過表達及抑制性載體,包裝慢病毒,體外實驗驗證ITGA1的表達水平變化對結(jié)直腸腫瘤癌生物學(xué)行為的影響。明確其在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的機制,判斷其是否可作為結(jié)直腸腫瘤治療新的靶點。方法1.Western Blot檢測ITGA1在5種結(jié)直腸腫瘤細胞系中的表達情況,同時檢測其在結(jié)直腸正常、腺瘤、癌組織中的表達情況,分析比較兩種表達情況,結(jié)合組織的臨床病理分型進行分析。2.免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測結(jié)直腸腫瘤(CRC)患者正常組織及腫瘤組織中ITGA1的表達情況。3.酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測腫瘤患者及健康人群血清中ITGA1的濃度。4.構(gòu)建ITGA1的過表達載體并包裝慢病毒,轉(zhuǎn)染NCM460(正常腸上皮細胞)細胞,構(gòu)建ITGA1的抑制表達載體并包裝慢病毒,轉(zhuǎn)染SW480(原位癌細胞)細胞,并篩選出穩(wěn)定表達的細胞株。5.Transwell及劃痕實驗分別檢測ITGA1對細胞增殖和遷移的影響。6.體外裸鼠成瘤實驗驗證細胞學(xué)實驗結(jié)果。結(jié)果1.Western Blot檢測ITGA1在NCM460(正常腸上皮細胞)、SW480(原位癌細胞)、SW620(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞)、HCT116(原位癌細胞)、HT29(原位癌細胞)細胞系中的表達,通過ImageJ專業(yè)軟件分析后可以看出,ITGA1在正常長腸上皮細胞NCM460(灰度值310±4.3)中低表達,在腫瘤細胞系SW480(灰度值949.4±48.3)、sw620(灰度值414.2±10.5)、hct116(灰度值557.0±46.0)、ht29(灰度值367.4±2.4)中有不同程度的高表達,量化灰度值之后差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。2.westernblot檢測itga1在結(jié)直腸腫瘤患者正常組織、癌旁組織、腺瘤組織及腫瘤組織中的表達,通過imagej及primer5.0專業(yè)軟件分析后可以看出itga1在正常組織(101.2±1.7)中低表達,在癌旁組織(307.2±56.7)、腺瘤組織(1015.0±13.8)及腫瘤組織(2749.0±15.7)中有不同程度的高表達,結(jié)果與細胞系表達情況一致。3.real-timepcr結(jié)果與westernblot結(jié)果一致,驗證了我們前期的實驗成果。4.免疫組化:正常組織itga1陽性細胞數(shù)為985±683個/每視野,腫瘤組織itga1陽性細胞數(shù)為4888±2612個/每視野,正常組織與腫瘤組織中itga1陽性細胞數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。結(jié)直腸腫瘤組織中itga1陽性強度:弱陽性(+)7例,中等陽性(++)21例,強陽性(+++)12例。5.elisa:正常人群血清中itga1的濃度為(1.79±0.43)μg/ml,結(jié)直腸腫瘤患者血清中itga1的濃度為(4.19±1.82)μg/ml。正常人群與結(jié)直腸腫瘤患者血清中itga1的濃度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。腫瘤患者血清樣本中itga1的濃度在性別,年齡,發(fā)病部位,duke's分期(abcd期),及結(jié)直腸腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(carcino-embryonicantigencea),ca125(糖類抗原)中的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。在tnm(i,ii,iii,iv期)分期,ca199(糖類抗原)中的濃度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。腫瘤患者血清中itga1的濃度與cea之間存在著正相關(guān)關(guān)系(r=0.516)。與腫瘤標(biāo)志物ca125(糖類抗原),ca19-9(糖類抗原)之間的相關(guān)性較低。6.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染itga1慢病毒,westernblot檢測itga1在轉(zhuǎn)染病毒細胞中的表達情況,通過imagej專業(yè)軟件分析后可以看出,過表達ncm460細胞(592.9±65.9)較正常ncm460細胞(425.8±37.6)itga1的表達量升高,干擾sw480細胞(7.7±3.4)較正常sw480細胞(120.9±4.8)itga1的表達量降低。說明itga1在結(jié)直腸正常及腫瘤細胞中有一定的影響作用。7.transewll結(jié)果顯示,sw480細胞轉(zhuǎn)染干擾性病毒后侵襲能力較正常sw480細胞有所降低。正常SW480細胞侵襲數(shù)目為(134±5),Anti-ITGA1-SW480細胞侵襲數(shù)目為(116±2),兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。說明ITGA1對細胞的侵襲能力有所影響。8.劃痕實驗結(jié)果顯示,與正常NCM460細胞相比,過表達NCM460細胞遷移能力明顯高于正常NCM460細胞。與正常SW480細胞相比,Anti-ITGA1-SW480細胞遷移能力低于正常SW480細胞。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。說明ITGA1對細胞的遷移能力有所影響。9.裸鼠成瘤實驗及免疫組化Ki67實驗表明:正常腸上皮細胞NCM460成瘤組織中Ki67表達幾乎為陰性,過表達NCM460成瘤組織中有弱陽性表達。SW480成瘤組織中陽性細胞數(shù)為(8187±2137),Anti-ITGA1-SW480成瘤組織中陽性細胞數(shù)為(7105±1994),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。說明ITGA1在細胞的成瘤過程中起著一定的作用。結(jié)論ITGA1在結(jié)直腸腫瘤細胞系、組織及血清中均高表達,抑制ITGA1的表達可相對降低腫瘤細胞的侵襲、遷移及增值能力,整合素α1(ITGA1)可能在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的調(diào)控作用,并有可能作為抑制結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要靶點。
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【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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本文編號：2457564