【摘要】：特定分布于乳腺內(nèi)的微鈣化灶是乳腺癌的一個重要特征,也可能是部分早期乳腺癌的唯一征象,檢測并鑒別微鈣化的性質(zhì)可能成為早期診斷乳腺癌的重要手段。拉曼光譜技術(shù)是一種擁有巨大潛力的乳腺疾病診斷技術(shù),目前對于該方法的研究工作主要集中于乳腺腫瘤、微鈣化的檢測、診斷以及術(shù)中應(yīng)用方面。但這些研究的對象多為石蠟病理切片,經(jīng)過福爾馬林固定及石蠟包埋處理會產(chǎn)生熒光背景,從而影響拉曼光譜分析。目前為止,研究中尚沒有對新鮮乳腺組織中的微鈣化進(jìn)行檢測及分析。而且對于乳腺腫瘤中微鈣化的形成方式和原因研究較少,目前亦沒有乳腺細(xì)胞鈣化體外模型的存在以研究該過程中的分子機(jī)制。為此,本研究首先使用共聚焦顯微拉曼光譜檢測新鮮乳腺組織連續(xù)冰凍切片,以區(qū)分纖維腺瘤、癌前病變即導(dǎo)管上皮非典型增生、導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤性導(dǎo)管癌中的微鈣化,通過拉曼光譜分析這些組織中微鈣化的生化特征。隨后,基于這些特征進(jìn)一步研究乳腺癌細(xì)胞中微鈣化形成機(jī)制,探討乳腺癌細(xì)胞中骨橋蛋白的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞微鈣化形成的相關(guān)性�；谝陨系难芯克悸�,本論文的主要研究內(nèi)容如下:(1)基于拉曼光譜的乳腺癌組織微鈣化的分子學(xué)特征研究使用共聚焦顯微拉曼光譜檢測乳腺組織連續(xù)冰凍切片,準(zhǔn)確定位微鈣化的位置。將殼層隔絕納米粒子增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SHINERS)用于檢測乳腺纖維腺瘤,癌前病變,導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤性癌組織冰凍切片,描述了乳腺組織冰凍切片中微鈣化的拉曼光譜分子學(xué)特征。鈣化灶主要特征峰為960cm-1,可以歸屬為羥基磷灰石鈣化磷酸鹽(PO4)的振動模式,為II型微鈣化。同時也檢測到了其他幾類生化成分的特征峰如類胡蘿卜素、脂類、蛋白質(zhì)和核苷酸等的出現(xiàn),而且這些較弱的特征峰在這四種病變組織之間也存在一些差異。首先,從乳腺導(dǎo)管上皮非典型增生到導(dǎo)管內(nèi)癌,再到浸潤性癌組織癌變過程中,蛋白質(zhì)和核苷酸的含量逐漸增加而脂類的含量逐漸降低。其次,乳腺纖維腺瘤和非典型增生中有相同的1072cm-1特征峰,可歸屬為核苷酸。這表明在乳腺病變組織中微鈣化沉積位置同時伴有核苷酸沉積。但在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤性癌組織中該特征峰由1072cm-1位移到1078cm-1位置,該位移可能是由于不同疾病組織中微鈣化的成分不同而導(dǎo)致。同時在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤性癌組織中,酰胺I特征峰(1653cm-1)消失。這可能是由于在細(xì)胞癌變過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象被破壞而導(dǎo)致。此外,導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤性癌組織中CH2特征峰(1446cm-1)發(fā)生藍(lán)移,這可能預(yù)示著脂類和蛋白質(zhì)�；羌艿臄嗔�。同時使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)方法分析光譜數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)使用SHINERS拉曼光譜,可以有效的區(qū)分乳腺癌前病變組織即導(dǎo)管上皮非典型增生和導(dǎo)管內(nèi)癌組織,準(zhǔn)確率分別高達(dá)99.78%和97.62%。但是對于乳腺浸潤性癌組織使用SHINERS后其準(zhǔn)確率下降,其靈敏度為100%,特異性為99.17%,陽性預(yù)測值為97.56%,陰性預(yù)測值為100%�？梢岳梦⑩}化的拉曼光譜特征準(zhǔn)確識別并診斷乳腺纖維腺瘤、非典型增生、導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤性癌組織。(2)基于拉曼光譜的乳腺癌細(xì)胞微鈣化形成機(jī)制研究研究中將β甘油磷酸鹽和抗壞血酸(即成骨雞尾酒)添加到高侵襲性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系、SUM149、SUM159以及MDA-MB-468細(xì)胞系,以及低侵襲性乳腺癌MCF-7、BT-474、T-47D以及SKBR-3細(xì)胞系特定培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)細(xì)胞體外產(chǎn)生鈣化,成功建立乳腺細(xì)胞系體外鈣化模型,驗(yàn)證了乳腺癌細(xì)胞系體外產(chǎn)生鈣化的能力。該8種細(xì)胞系經(jīng)成骨雞尾酒處理后,在第7天經(jīng)茜素紅染色發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生鈣化物質(zhì)。拉曼光譜用來識別MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞所產(chǎn)生鈣化沉積的種類,其960cm-1處拉曼特征峰表明羥基磷灰石的出現(xiàn),與之前在新鮮乳腺組織冰凍切片中檢測到的微鈣化成分一致。隨后以人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231為主要研究對象,探索骨橋蛋白與乳腺癌微鈣化形成的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)成骨雞尾酒誘導(dǎo)后骨橋蛋白基因表達(dá)明顯上調(diào)(p=0.0009)。而后,使用骨橋蛋白sh RNA慢病毒載體將人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的骨橋蛋白進(jìn)行基因敲除,以觀察其是否仍能產(chǎn)生鈣化。細(xì)胞基因敲除成功后加成骨雞尾酒培養(yǎng)7天后茜素紅染色的定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨橋蛋白基因敲除后微鈣化產(chǎn)生的量明顯減少(p0.001),這表明細(xì)胞骨橋蛋白在人乳腺癌細(xì)胞微鈣化形成中起關(guān)鍵作用。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
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本文編號：2451122