【摘要】：背景:肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常見的類型,占肺癌總數(shù)的80-85%,嚴(yán)重威脅人類的健康。雖然手術(shù)、放療、化療等治療方法的不斷改進(jìn)在NSCLC患者的治療方面有了一定的提高,但患者的預(yù)后仍不盡人意,侵襲轉(zhuǎn)移仍然是影響患者生存質(zhì)量及預(yù)后的重要因素。近年來,有多項(xiàng)研究表明Dickkopf 1(DKK1)的表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但影響機(jī)制仍不清楚。目的:本研究從細(xì)胞水平探討DKK1在NSCLC遷移與侵襲能力中的作用,并探索其具體的影響機(jī)制。方法:本研究選擇NSCLC細(xì)胞系H1299及95C兩種細(xì)胞系,采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞的方法構(gòu)建DKK1低表達(dá)及其對(duì)照細(xì)胞模型,即H1299-DKK1-KD與H1299-NC、95C-DKK1-KD與95C-NC,熒光顯微鏡下觀察感染效果并用Western-blot檢測(cè)DKK1的表達(dá)以確認(rèn)感染效果;采用劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移與侵襲能力;采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NSCLC細(xì)胞系中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白、β-catenin及磷酸化β-catenin的表達(dá);應(yīng)用Wnt信號(hào)通路抑制劑IWP2降低β-catenin的表達(dá)并檢測(cè)IWP2對(duì)EMT、細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響,以確認(rèn)β-catenin在DKK1誘導(dǎo)的EMT、細(xì)胞遷移與侵襲能力中的關(guān)鍵作用;應(yīng)用GSK3β抑制劑Li Cl抑制β-catenin的磷酸化,以恢復(fù)β-catenin的表達(dá)并檢測(cè)Li Cl對(duì)EMT、細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響;采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin的亞細(xì)胞分布情況。結(jié)果:1.細(xì)胞熒光檢測(cè)結(jié)果表明,85%的細(xì)胞成功感染DKK1-sh RNA或NS(non-silencing)-sh RNA;Western-blot結(jié)果顯示,與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染NS-sh RNA的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染DKK1-sh RNA的細(xì)胞中DKK1的表達(dá)明顯下降。以上結(jié)果均提示,已成功構(gòu)建DKK1低表達(dá)(DKK1 knockdown,KD)模型H1299-DKK1-KD和95C-DKK1-KD,以及空載對(duì)照(negative control,NC)細(xì)胞模型H1299-NC和95C-NC。2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,劃痕24h后,H1299-DKK1-KD組細(xì)胞的劃痕愈合面積明顯低于H1299及H1299-NC組,95C-DKK1-KD細(xì)胞的劃痕愈合面積明顯低于95C及95C-NC組;Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與H1299及H1299-NC組細(xì)胞相比,H1299-DKK1-KD組細(xì)胞過膜細(xì)胞數(shù)明顯降低,與95C及95C-NC細(xì)胞相比,95C-DKK1-KD細(xì)胞的過膜細(xì)胞數(shù)明顯降低。以上結(jié)果表明,敲降DKK1的表達(dá)降低了NSCLC細(xì)胞的遷移能力。3.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與H1299及H1299-NC組細(xì)胞相比,H1299-DKK1-KD組細(xì)胞穿透Matrigel膠并侵襲到小室下側(cè)的細(xì)胞數(shù)目明顯降低;與95C及95C-NC細(xì)胞相比,95C-DKK1-KD細(xì)胞的過膜細(xì)胞數(shù)也明顯降低。以上結(jié)果表明,敲降DKK1的表達(dá)降低了NSCLC細(xì)胞的侵襲能力。4.Western-blot檢測(cè)DKK1對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,與H1299及H1299-NC細(xì)胞相比,H1299-DKK1-KD細(xì)胞的ZEB1及Snail表達(dá)水平明顯降低;在95C細(xì)胞系中,與95C及95C-NC細(xì)胞相比,95C-DKK1-KD細(xì)胞中ZEB1及Snail的表達(dá)水平明顯降低。以上結(jié)果提示,DKK1誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。5.Western-blot檢測(cè)DKK1對(duì)β-catenin表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,與H1299及H1299-NC細(xì)胞相比,H1299-DKK1-KD細(xì)胞中β-catenin表達(dá)水平降低,且β-catenin的磷酸化水平明顯提升;在95C細(xì)胞系中,與95C及95C-NC細(xì)胞相比,95C-DKK1-KD細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平明顯降低,且β-catenin的磷酸化水平明顯提升。以上結(jié)果提示,DKK1并未抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路,而是通過其他途徑提升了β-catenin的表達(dá)。6.應(yīng)用Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑IWP2抑制β-catenin的表達(dá),檢測(cè)IWP2對(duì)EMT、細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,DKK1表達(dá)水平相對(duì)較高的H1299和H1299-NC細(xì)胞,在經(jīng)IWP2作用后,EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞遷移與侵襲能力均下降;同樣地,DKK1表達(dá)水平相對(duì)較高的95C和95C-NC細(xì)胞,在經(jīng)IWP2作用后,EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞遷移與侵襲能力均下降。以上結(jié)果提示,IWP2有效地抑制了β-catenin的表達(dá),同時(shí)有效地抑制了DKK1誘導(dǎo)的EMT、細(xì)胞遷移與侵襲。7.應(yīng)用GSK3β抑制劑Li Cl抑制β-catenin的磷酸化,以恢復(fù)β-catenin的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)Li Cl對(duì)EMT、細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,H1299-DKK1-KD及95C-DKK1-KD細(xì)胞經(jīng)Li Cl作用后,EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞的遷移與侵襲能力均有所恢復(fù)。以上結(jié)果提示,Li Cl明顯消減了DKK1-KD對(duì)EMT相關(guān)蛋白、細(xì)胞遷移與侵襲能力的抑制作用。8.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,β-catenin在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均有分布,與NC細(xì)胞組相比,DKK1-KD細(xì)胞組中,核β-catenin的表達(dá)明顯降低。結(jié)論:1.DKK1的下調(diào)明顯抑制EMT發(fā)生,并抑制NSCLC細(xì)胞的遷移與侵襲能力。2.DKK1的表達(dá)與β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系,DKK1的下調(diào)促使β-catenin發(fā)生磷酸化進(jìn)行降解。3.β-catenin在DKK1誘導(dǎo)的EMT、細(xì)胞遷移與侵襲過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。4.DKK1通過抑制β-catenin發(fā)生磷酸化的過程而實(shí)現(xiàn)對(duì)β-catenin的調(diào)控。5.DKK1穩(wěn)定核內(nèi)β-catenin的表達(dá),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)EMT、細(xì)胞遷移與侵襲過程的作用。
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【學(xué)位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Stephanie M Yoon;Talha Shaikh;Mark Hallman;;Therapeutic management options for stage Ⅲ non-small cell lung cancer[J];World Journal of Clinical Oncology;2017年01期

2 Gerard J O'Sullivan;Fiona L Carty;Carmel G Cronin;;Imaging of bone metastasis: An update[J];World Journal of Radiology;2015年08期

3 李書琴;楊珊;任嬡姝;戴紅衛(wèi);;張應(yīng)力刺激下Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞Runx2表達(dá)調(diào)控的體外研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2015年01期

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本文編號(hào)：2450403