【摘要】：背景:肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常見的類型,占肺癌總數(shù)的80-85%,嚴重威脅人類的健康。雖然手術(shù)、放療、化療等治療方法的不斷改進在NSCLC患者的治療方面有了一定的提高,但患者的預后仍不盡人意,侵襲轉(zhuǎn)移仍然是影響患者生存質(zhì)量及預后的重要因素。近年來,有多項研究表明Dickkopf 1(DKK1)的表達與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但影響機制仍不清楚。目的:本研究從細胞水平探討DKK1在NSCLC遷移與侵襲能力中的作用,并探索其具體的影響機制。方法:本研究選擇NSCLC細胞系H1299及95C兩種細胞系,采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染貼壁細胞的方法構(gòu)建DKK1低表達及其對照細胞模型,即H1299-DKK1-KD與H1299-NC、95C-DKK1-KD與95C-NC,熒光顯微鏡下觀察感染效果并用Western-blot檢測DKK1的表達以確認感染效果;采用劃痕和Transwell實驗檢測細胞的遷移與侵襲能力;采用Western blot實驗檢測NSCLC細胞系中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白、β-catenin及磷酸化β-catenin的表達;應用Wnt信號通路抑制劑IWP2降低β-catenin的表達并檢測IWP2對EMT、細胞遷移與侵襲能力的影響,以確認β-catenin在DKK1誘導的EMT、細胞遷移與侵襲能力中的關(guān)鍵作用;應用GSK3β抑制劑Li Cl抑制β-catenin的磷酸化,以恢復β-catenin的表達并檢測Li Cl對EMT、細胞遷移與侵襲能力的影響;采用細胞免疫熒光實驗檢測β-catenin的亞細胞分布情況。結(jié)果:1.細胞熒光檢測結(jié)果表明,85%的細胞成功感染DKK1-sh RNA或NS(non-silencing)-sh RNA;Western-blot結(jié)果顯示,與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞及轉(zhuǎn)染NS-sh RNA的細胞相比,轉(zhuǎn)染DKK1-sh RNA的細胞中DKK1的表達明顯下降。以上結(jié)果均提示,已成功構(gòu)建DKK1低表達(DKK1 knockdown,KD)模型H1299-DKK1-KD和95C-DKK1-KD,以及空載對照(negative control,NC)細胞模型H1299-NC和95C-NC。2.細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,劃痕24h后,H1299-DKK1-KD組細胞的劃痕愈合面積明顯低于H1299及H1299-NC組,95C-DKK1-KD細胞的劃痕愈合面積明顯低于95C及95C-NC組;Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示,與H1299及H1299-NC組細胞相比,H1299-DKK1-KD組細胞過膜細胞數(shù)明顯降低,與95C及95C-NC細胞相比,95C-DKK1-KD細胞的過膜細胞數(shù)明顯降低。以上結(jié)果表明,敲降DKK1的表達降低了NSCLC細胞的遷移能力。3.Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果顯示,與H1299及H1299-NC組細胞相比,H1299-DKK1-KD組細胞穿透Matrigel膠并侵襲到小室下側(cè)的細胞數(shù)目明顯降低;與95C及95C-NC細胞相比,95C-DKK1-KD細胞的過膜細胞數(shù)也明顯降低。以上結(jié)果表明,敲降DKK1的表達降低了NSCLC細胞的侵襲能力。4.Western-blot檢測DKK1對EMT相關(guān)蛋白表達的影響,結(jié)果顯示,與H1299及H1299-NC細胞相比,H1299-DKK1-KD細胞的ZEB1及Snail表達水平明顯降低;在95C細胞系中,與95C及95C-NC細胞相比,95C-DKK1-KD細胞中ZEB1及Snail的表達水平明顯降低。以上結(jié)果提示,DKK1誘導EMT的發(fā)生。5.Western-blot檢測DKK1對β-catenin表達的影響,結(jié)果顯示,與H1299及H1299-NC細胞相比,H1299-DKK1-KD細胞中β-catenin表達水平降低,且β-catenin的磷酸化水平明顯提升;在95C細胞系中,與95C及95C-NC細胞相比,95C-DKK1-KD細胞中β-catenin的表達水平明顯降低,且β-catenin的磷酸化水平明顯提升。以上結(jié)果提示,DKK1并未抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路,而是通過其他途徑提升了β-catenin的表達。6.應用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑IWP2抑制β-catenin的表達,檢測IWP2對EMT、細胞遷移與侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,DKK1表達水平相對較高的H1299和H1299-NC細胞,在經(jīng)IWP2作用后,EMT相關(guān)蛋白表達水平、細胞遷移與侵襲能力均下降;同樣地,DKK1表達水平相對較高的95C和95C-NC細胞,在經(jīng)IWP2作用后,EMT相關(guān)蛋白表達水平、細胞遷移與侵襲能力均下降。以上結(jié)果提示,IWP2有效地抑制了β-catenin的表達,同時有效地抑制了DKK1誘導的EMT、細胞遷移與侵襲。7.應用GSK3β抑制劑Li Cl抑制β-catenin的磷酸化,以恢復β-catenin的表達,同時檢測Li Cl對EMT、細胞遷移與侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,H1299-DKK1-KD及95C-DKK1-KD細胞經(jīng)Li Cl作用后,EMT相關(guān)蛋白的表達水平、細胞的遷移與侵襲能力均有所恢復。以上結(jié)果提示,Li Cl明顯消減了DKK1-KD對EMT相關(guān)蛋白、細胞遷移與侵襲能力的抑制作用。8.細胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示,β-catenin在細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核中均有分布,與NC細胞組相比,DKK1-KD細胞組中,核β-catenin的表達明顯降低。結(jié)論:1.DKK1的下調(diào)明顯抑制EMT發(fā)生,并抑制NSCLC細胞的遷移與侵襲能力。2.DKK1的表達與β-catenin表達呈正相關(guān)關(guān)系,DKK1的下調(diào)促使β-catenin發(fā)生磷酸化進行降解。3.β-catenin在DKK1誘導的EMT、細胞遷移與侵襲過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。4.DKK1通過抑制β-catenin發(fā)生磷酸化的過程而實現(xiàn)對β-catenin的調(diào)控。5.DKK1穩(wěn)定核內(nèi)β-catenin的表達,進而實現(xiàn)對EMT、細胞遷移與侵襲過程的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Stephanie M Yoon;Talha Shaikh;Mark Hallman;;Therapeutic management options for stage Ⅲ non-small cell lung cancer[J];World Journal of Clinical Oncology;2017年01期

2 Gerard J O'Sullivan;Fiona L Carty;Carmel G Cronin;;Imaging of bone metastasis: An update[J];World Journal of Radiology;2015年08期

3 李書琴;楊珊;任嬡姝;戴紅衛(wèi);;張應力刺激下Wnt/β-catenin信號通路對成牙骨質(zhì)細胞Runx2表達調(diào)控的體外研究[J];華西口腔醫(yī)學雜志;2015年01期

，

本文編號：2450403