【摘要】：研究背景腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cell,CSC)是指腫瘤組織中的一群具有無(wú)限自我更新能力的細(xì)胞,是促使腫瘤無(wú)限生長(zhǎng)的來(lái)源。CSC能夠抵抗放化療的殺傷,是腫瘤復(fù)發(fā)的蓄庫(kù)和轉(zhuǎn)移的根源。如何有效抑制或清除CSC成為了當(dāng)今腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),而誘導(dǎo)并維持CSC多潛能“干性”的分子機(jī)制是CSC研究的核心問(wèn)題。Cdc6(cell division cycle 6)主要功能為起始DNA復(fù)制,在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)且與腫瘤惡性進(jìn)程相關(guān),而Cdc6的高表達(dá)不僅僅是腫瘤旺盛增殖所導(dǎo)致的結(jié)果,Cdc6本身就有促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。最近研究發(fā)現(xiàn),Cdc6在腫瘤細(xì)胞中可作為轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制抑癌基因INK4/ARF的轉(zhuǎn)錄,INK4/ARF能同時(shí)編碼3個(gè)蛋白:p16INK4A、p15INK4B和p14ARF,分別通過(guò)pRb和p53通路調(diào)控細(xì)胞周期。INK4/ARF在人類(lèi)腫瘤中出現(xiàn)頻發(fā)的失活,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。而且此基因轉(zhuǎn)錄抑制是CSC多潛能“干性”的重要特征,因此Cdc6極有可能通過(guò)抑制INK4/ARF參與CSC多潛能“干性”。去甲斑蝥素(Norcantharidin)是我國(guó)自主研發(fā)的抗腫瘤藥物,目前被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療,但其具體的抗腫瘤機(jī)制目前仍未完全闡明,本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)NCTD能降解腫瘤細(xì)胞Cdc6蛋白,發(fā)揮抗腫瘤活性。研究目的1、通過(guò)有限稀釋法從建系腫瘤細(xì)胞株中篩選獲得CSC,并鑒定。2、探究在CSC中,Cdc6蛋白表達(dá)情況及其是否參與調(diào)控INK4/ARF基因。3、探究去甲斑蝥素(抑制Cdc6)對(duì)CSC的影響。研究方法1、CSC篩選:取建系的腫瘤細(xì)胞HepG2和UMUC-3,超低吸附培養(yǎng)板中進(jìn)行單克隆培養(yǎng),加入無(wú)血清培養(yǎng)基(含EGF 20ng/mL、b-FGF 20ng/mL、LIF 20ng/mL、干細(xì)胞添加劑B27 20μL/mL和BSA 4μg/mL的DMEM/F12培養(yǎng)基),連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月以上獲得。2、CSC鑒定:利用qPCR、流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44、NANOG、OCT4、ABCG2;裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞成瘤能力。3、CSC功能學(xué)方面檢測(cè):MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外細(xì)胞增殖及化療藥物的殺傷、EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA復(fù)制、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。4、通過(guò)Western blotting和Chromatin binding檢測(cè)Cdc6蛋白總量及染色質(zhì)中和非染色質(zhì)部分的表達(dá)。5、通過(guò) Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)檢測(cè) Cdc6 與 INK4/ARF 基因調(diào)控區(qū)域的相互作用。6、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。研究結(jié)果1、HepG2和UMUC-3經(jīng)有限稀釋法培養(yǎng)5天可見(jiàn)成球生長(zhǎng)的單克隆細(xì)胞團(tuán),培養(yǎng)20天后取單克隆細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至60天。2、CSC鑒定:流式細(xì)胞結(jié)果顯示,篩選60天的HepG2細(xì)胞CD133+比例高達(dá)90.4±1.1%,顯著高于母代腫瘤細(xì)胞(0.5±0.2%),CD44+比例為0.5±0.12%也高于母代腫瘤細(xì)胞(0.1±0.04%)。qPCR結(jié)果顯示CD133、CD44、NANOG、OCT4、ABCG2的mRNA含量均顯著高于母代腫瘤細(xì)胞。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示,接種篩選后的HepG2細(xì)胞(1×105個(gè)/只)成瘤率為1/5,5×106個(gè)/只的成瘤率為3/5,而相對(duì)應(yīng)的母代HepG2均未成瘤。這些結(jié)果表明通過(guò)本方法篩選出的細(xì)胞即為CSC。3、CSC對(duì)紫杉醇耐藥(PTX)。MTS結(jié)果顯示:PTX對(duì)HepG2-CSC和UMUC-3-CSC 的 IC50 均500nM/ml,遠(yuǎn)大于其對(duì)母代 HepG2(60.9±5.7)、UMUC-3(63.0±4.8)。4、CSC為靜止休眠期細(xì)胞。流式細(xì)胞細(xì)胞周期檢測(cè)顯示CSC的G0/G1期比例顯著提高(HepG2-CSC:70.72±5.2%,UMUC-3-CSC:70.24±4.9);EdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示CSC幾乎無(wú)DNA復(fù)制,表明CSC大多處于靜止期。血清釋放后靜止的CSC重新進(jìn)入增殖周期,且血清釋放四天后,CSC的增殖速率顯著高于母代腫瘤細(xì)胞。4、靜止休眠期CSC中Cdc6的表達(dá)。Chromatin binding顯示,靜止期CSC的Cdc6仍有相當(dāng)數(shù)量的表達(dá),且大多結(jié)合于染色質(zhì)上,與相對(duì)應(yīng)的母代腫瘤細(xì)胞相比,非染色質(zhì)部分的含量顯著降低。血清釋放進(jìn)入增殖周期后,非染色質(zhì)結(jié)合的Cdc6逐漸增多,至24小時(shí)后恢復(fù)到與母代腫瘤細(xì)胞相似的水平。5、通過(guò)ChIP顯示,在CSC中,Cdc6結(jié)合在INK4/ARF基因調(diào)控區(qū)(RDINK4/ARF)(-311～-157)區(qū)域,而在-175～-51區(qū)域沒(méi)有結(jié)合。6、CSC加入NCTD培養(yǎng)后,HepG2-CSC和UMUC-3-CSC凋亡比例(70.54±0.26%,29.93±1.32%)顯著高于對(duì)照組(35.00±0.89%,15.11±0.78%)。研究結(jié)論1、通過(guò)有限稀釋法能有效地從建系腫瘤細(xì)胞株中篩選獲得處于靜止休眠期的 CSC。2、靜止期CSC中Cdc6仍然在染色質(zhì)中表達(dá)且與RDINK4/ARF結(jié)合。3、NCTD可誘導(dǎo)靜止期CSC凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R73-3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 宮晨;廖暉;郭風(fēng)勁;秦亮;祁軍;;Implication of Expression of Nanog in Prostate Cancer Cells and Their Stem Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2012年02期

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本文編號(hào)：2446337