【摘要】：目的:1.探討應(yīng)用順鉑聯(lián)合無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法篩選并富集肺腺癌腫瘤干細(xì)胞的可行性;2.探討miR-192在肺腺癌干細(xì)胞和親代細(xì)胞中的表達(dá)差異;3.初步探討mi R-192對(duì)肺腺癌細(xì)胞及肺癌干細(xì)胞干細(xì)胞特性的調(diào)控作用。方法:1.將人肺腺癌細(xì)胞系PC9應(yīng)用順鉑篩選后于無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基的中培養(yǎng)3周。2.應(yīng)用CCK-8法繪制生長(zhǎng)曲線比較CSCs與PC9細(xì)胞增殖能力的差別;應(yīng)用平板克隆實(shí)驗(yàn)對(duì)比CSCs與PC9細(xì)胞的克隆能力;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CSCs與PC9細(xì)胞中SP細(xì)胞比例的差別;應(yīng)用RT-PCR技術(shù)及Western-blot檢測(cè)CSCs與PC9細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)差別。3.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CSCs與PC9細(xì)胞中mi R-192的表達(dá)差異。4.應(yīng)用懸浮培養(yǎng)法分別比較miR-192及miR-192 inhibitor對(duì)CSCs、PC9細(xì)胞成球率的影響;應(yīng)用CCK-8法繪制生長(zhǎng)曲線比較miR-192及miR-192 inhibitor對(duì)CSCs、PC9細(xì)胞增殖能力的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)比較miR-192及miR-192inhibitor對(duì)CSCs SP細(xì)胞比例的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)比較miR-192對(duì)PC9細(xì)胞周期的影響;應(yīng)用RT-PCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)比較miR-192及miR-192inhibitor對(duì)CSCs、PC9細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1.經(jīng)順鉑聯(lián)合無(wú)血清培養(yǎng)篩選后,CSCs細(xì)胞形態(tài)與親代PC9細(xì)胞存在顯著差別;2.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及平板克隆實(shí)驗(yàn)提示PC9-CSC具有更強(qiáng)的增殖能力(P0.000),(P=0.003);3.PC9-CSC較PC9細(xì)胞中SP細(xì)胞含量顯著增多(13.16±1.12%vs.1.21±0.64%)(P0.000);4.pc9-csc中abcg2、cd133、oct4、nanogmrna表達(dá)顯著高于親代pc9細(xì)胞分別為親代pc9細(xì)胞的3.44±0.12、2.06±0.11、5.51±0.20、6.04±0.22倍(p0.000~0.000);5.pc9-csc中abcg2、cd133、oct4、nanog蛋白表達(dá)水平高于親代pc9細(xì)胞,灰度值分別為親代pc9細(xì)胞的1.54±0.13,1.19±0.08,1.372±0.11,1.31±0.12倍(p=0.002~0.012);各組細(xì)胞的內(nèi)參蛋白β-actin表達(dá)水平一致(p0.05);6.pc9-csc中mir-192表達(dá)量較親代pc9組顯著增高4.21±0.46倍(p0.000);7.pc9轉(zhuǎn)染mir-192mimic后成球率增高(17.00±3.00vs.54.22±13.53)(p=0.009);pc9-csc轉(zhuǎn)染mir-192mimic后成球率增高(153.667±14.74vs.107.00±11.00)(p=0.008);pc9-csc轉(zhuǎn)染mir-192inhibitor后成球率較pc9-csc降低不顯著(92.00±7.00vs.112.333±12.51)(p=0.406);8.生長(zhǎng)曲線提示pc9轉(zhuǎn)染mir-192mimic后增殖能力增強(qiáng)(p0.000);pc9-csc轉(zhuǎn)染mir-192mimic后增殖能力增強(qiáng)(p0.000);pc9-csc轉(zhuǎn)染mir-192inhibitor后增殖能力降低(p0.000);9.pc9-cscs轉(zhuǎn)染mir-192mimic后sp細(xì)胞含量增多(16.32±0.87%vs.13.26±0.74%)(p=0.018);pc9-csc轉(zhuǎn)染mir-192inhibitor后sp細(xì)胞含量減少(9.43±0.71%vs.12.76±0.54%)(p=0.002);10.細(xì)胞周期結(jié)果顯示,pc9轉(zhuǎn)染mir-192mimic后g2/m期比例顯著增高(28.1±0.5%vs13.4%±0.3)(p0.000);11.rt-pcr結(jié)果顯示,pc9轉(zhuǎn)染mir-192mimic后abcg2、cd133、oct4、nanogmrna表達(dá)顯著增高,分別為對(duì)照組的2.19±0.12、2.06±0.11、3.21±0.21、2.89±0.27倍(p0.000~0.001);pc9-csc轉(zhuǎn)染mir-192mimics后abcg2、cd133、oct4、nanogmrna表達(dá)顯著增高,分別為對(duì)照組的1.61±0.14、1.42±0.13、1.49±0.17、1.34±0.12倍(p=0.004~0.033);pc9-csc轉(zhuǎn)染mir-192inhibitor后abcg2、cd133mrna表達(dá)降低,分別為對(duì)照組的0.73±0.09、0.62±0.14倍(p=0.020~0.041),oct-4、nanog降低不顯著(p0.05);12.westernblot結(jié)果結(jié)果顯示,pc9轉(zhuǎn)染mir-192mimic后cd133蛋白表達(dá)顯著增高,灰度值為對(duì)照組的1.18±0.04倍(P=0.002),abcg2、oct4、nanog灰度值與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P0.05);PC9-CSC轉(zhuǎn)染miR-192 mimic后oct4、nanog蛋白表達(dá)顯著增高,灰度值分別為對(duì)照組的1.12±0.04、1.13±0.03倍(P=0.003~0.014),abcg2、cd133灰度值與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P0.05);PC9-CSC轉(zhuǎn)染miR-192 inhibitor后abcg2、cd133、oct4、nanog蛋白表達(dá)顯著降低,灰度值分別為對(duì)照組的0.88±0.04、0.90±0.04、0.87±0.02、0.90±0.02倍(P=0.001~0.026);各組細(xì)胞的內(nèi)參蛋白β-actin表達(dá)水平一致(P0.05)。結(jié)論:1.利用順鉑聯(lián)合無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)能夠篩選并富集腫瘤干細(xì)胞。2.篩選出的CSCs具有更強(qiáng)的增殖能力、更高的SP細(xì)胞比例、更多的干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)等干細(xì)胞特征。3.miR-192的表達(dá)量在富集的CSCs中顯著增高,并且可能對(duì)肺腺癌腫瘤干細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 張芳;李洋;吳蘅;齊康;尤嘉琮;李雪冰;祖玲玲;潘振華;王玉麗;李永文;李穎;王珉;沈旺;周清華;;MiR-192靶向負(fù)調(diào)控Bim表達(dá)誘導(dǎo)肺癌順鉑耐藥[J];中國(guó)肺癌雜志;2014年05期

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本文編號(hào)：2445814