【摘要】：肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是危害我國人民健康的重大疾病之一,其發(fā)病率列全球惡性腫瘤第六位,死亡率列第三位。HCC是一種血管豐富的腫瘤,相對于其他實(shí)體腫瘤而言,其早期發(fā)現(xiàn)比較困難,確診時高達(dá)90%以上的患者已屬中、晚期。值得我們關(guān)注的是,HCC具有高轉(zhuǎn)移性和侵襲性的特征,特別是肝內(nèi)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及頻繁的術(shù)后復(fù)發(fā),是導(dǎo)致其高死亡率的主要原因。為了提高早期診斷和改善預(yù)后,我們迫切需要進(jìn)一步探究促進(jìn)HCC發(fā)展和發(fā)生早期轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)制。同時,大量的臨床病例資料顯示HCC的發(fā)生及進(jìn)展還表現(xiàn)出顯著的性別差異。逐漸得到的共識是雌激素在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用,但是,相比于其他性激素敏感器官,雌激素在肝癌中作用的研究相對較少,特別是對分子機(jī)理的探討明顯不足。因此,本研究以大量人體慢性肝炎及肝細(xì)胞癌標(biāo)本為基礎(chǔ),結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)及動物模型,系統(tǒng)研究了ERa及miR-30e在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其分子機(jī)制,獲得以下主要結(jié)果：1.基于大量人類肝細(xì)胞肝癌臨床標(biāo)本,我們利用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組織化學(xué)的方法以人正常肝組織為對照,分別檢測肝癌切除術(shù)后所得的腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated gene 1, MTA1)的表達(dá)水平,通過Kaplan-Meier曲線研究不同MTA1表達(dá)水平與HCC患者生存率及復(fù)發(fā)率之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MTA1在肝癌組織及癌旁肝硬化組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯高于正常組織(P0.01),同時,MTA1蛋白在肝癌組織及癌旁肝硬化組織中的表達(dá)也明顯高于正常組織(P0.01)。通過Kaplan-Meier曲線及Log-rank檢驗(yàn)證明MTA1能夠影響腫瘤的復(fù)發(fā)及患者的生存期。本研究通過對以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析提示,MTA1可以作為判斷肝癌肝切除術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及患者生存率預(yù)測的指標(biāo)。2.肝癌發(fā)病性別差異一直是國際肝癌學(xué)術(shù)界研究熱點(diǎn),基于大量人類肝癌標(biāo)本,我們利用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot的方法檢測MTA1基因的表達(dá)水平；運(yùn)用Edu摻入和Transwell、室侵襲實(shí)驗(yàn)分別就MTA1對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響進(jìn)行評估；并利用shRNA技術(shù)和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)來研究細(xì)胞系中ERa對MTA1的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MTA1在男性HCC及癌旁組織中較正常肝組織顯著性地高表達(dá),然而,在女性患者標(biāo)本中沒有類似發(fā)現(xiàn)。并且與正常肝組織比較,ERa在男性腫瘤和癌旁組織中表達(dá)顯著地降低,男性腫瘤及癌旁組織中MTA1增加量與ERa減少量呈線性相關(guān)。通過體外細(xì)胞模型及啟動子活性分析表明,MTA1啟動子上有3個功能性雌激素受體結(jié)合元件(ERE)的半結(jié)合位點(diǎn),雌激素(E2)能夠結(jié)合ERa從轉(zhuǎn)錄水平抑制肝癌細(xì)胞中MTA1的表達(dá)。過表達(dá)ERa可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力；另一方面,過表達(dá)MTA1可以減弱ERa介導(dǎo)的對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用以及其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,對腫瘤形成的抑制作用。這表明,ERa和MTA1之間存在反饋調(diào)節(jié)關(guān)系�？傊�,我們的結(jié)果表明,ERa通過下調(diào)MTA1基因的轉(zhuǎn)錄,抑制了人肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。因此,通過本研究我們闡明了另一條可用于解釋肝癌發(fā)病性別差異性的通路：男性肝癌及癌旁組織中ERa下調(diào),從而使處于肝硬化和癌變早期的肝細(xì)胞失去雌激素的保護(hù)作用,并導(dǎo)致MTA1高表達(dá),最終通過其下游信號通路激活導(dǎo)致肝癌的在男性中高發(fā)。3.已知MTA1是一個典型的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白,它在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生的過程中是至關(guān)重要的,然而,涉及其上、下游調(diào)控機(jī)制的相關(guān)知識我們還知之甚少。本研究中,我們致力于探討在人類肝細(xì)胞癌(HCC)中MTA1上游的調(diào)控因子和其下游的效應(yīng)靶點(diǎn)以及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中我們采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組化的方法檢測不同基因的表達(dá)水平,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和生物信息學(xué)方法來預(yù)測它們之間潛在的相關(guān)性和調(diào)控關(guān)系,并進(jìn)一步通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證上述調(diào)控關(guān)系。我們的研究納入了總共94對HCC腫瘤和癌旁組織樣本,檢測結(jié)果表明,在人類HCC中,miR-30e的減少與MTA1的增加相關(guān)聯(lián),miR.-30e可以結(jié)合在MTA1基因的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控MTA1的表達(dá),并與EMT的發(fā)生負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步的,在人類HCC中,MTA1的顯著高表達(dá)與ErbB2的過表達(dá)相關(guān)聯(lián),MTA1可與組蛋白去乙�；�(HDAC2)結(jié)合形成復(fù)合物作為一個轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)ErbB2的轉(zhuǎn)錄。MTA1促進(jìn)EMT發(fā)生的效應(yīng)很大程度上依賴于ErbB2,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明或是沉默或是抑制了ErbB2的活性,可以顯著地減弱由過表達(dá)MTA1所介導(dǎo)的EMT的發(fā)生�？傊�,我們的研究表明,在人類HCC中miR-30e的下調(diào)可以增加MTA1的表達(dá),并進(jìn)一步地通過增加ErbB2的表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。綜上所述,通過我們的研究表明,MTA1不僅參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展,而且與其術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后不良以及低生存率等臨床特征密切相關(guān)。一方面,ERa在男性肝癌及癌旁組織中下調(diào),通過轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,導(dǎo)致MTA1高表達(dá),有利于增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,影響肝癌惡性程度及轉(zhuǎn)移潛能等生物學(xué)特性；另一方面,在人類HCC中下調(diào)的miR-30e也可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控MTA1的表達(dá),并進(jìn)一步地通過增加ErbB2的表達(dá),促進(jìn)EMT的發(fā)生進(jìn)而增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果有利于我們更深入了解MTA1促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,增加對肝癌發(fā)生發(fā)展中性別差異性的理解,同時也為肝癌的預(yù)防和治療提供了新靶標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2445588