【摘要】：胃癌是我國主要的惡性腫瘤之一,發(fā)病率及死亡率均僅次于肺癌位居次席。目前確診的胃癌,大部分都處于進(jìn)展期,根治術(shù)后5年生存率長期徘徊在20-30%,惡性程度高、預(yù)后差。因此,進(jìn)一步闡明胃癌發(fā)病的分子機(jī)制,尋找理想的早期診斷標(biāo)志物,以及高效特異的治療靶點,已經(jīng)成為當(dāng)今胃癌研究中的重大問題。微小RNA是一種內(nèi)源小分子非編碼RNA,其可與靶基因的3’UTR不完全互補(bǔ)結(jié)合,從而直接降解靶m RNA或抑制靶m RNA的翻譯。近年來大量研究表明,miRNA參與了人體內(nèi)幾乎所有生理過程,如細(xì)胞的發(fā)育分化、增殖和凋亡。更重要的是,miRNA被發(fā)現(xiàn)對多種人類癌癥的發(fā)病機(jī)理也有影響,因此,尋找miRNA分子及其靶基因的研究已成為基因調(diào)控研究領(lǐng)域的重要分支和熱點。有研究發(fā)現(xiàn),某些miRNA表達(dá)水平在胃癌和癌旁正常組織中存在顯著差異,并與胃癌浸潤深度、組織學(xué)類型及患者預(yù)后等臨床指標(biāo)密切相關(guān)。為了深入研究miRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用,本研究對100種miRNA進(jìn)行了高通量功能篩選,最終選定了抑制細(xì)胞遷移能力最強(qiáng)的miR-451,檢測其在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)量,然后研究了miR-451對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移侵襲、EMT的影響,并對miR-451的靶基因進(jìn)行預(yù)測鑒定,最后檢測其下游靶基因ERK2對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。第一部分:高通量功能篩選對胃癌細(xì)胞遷移有影響的miRNA目的:高通量功能篩選與胃癌細(xì)胞遷移相關(guān)的miRNA。方法:通過SAMcell技術(shù)在人胃癌細(xì)胞系SGC-7901中對100種miRNA進(jìn)行高通量功能篩選。結(jié)果:確定了22種在胃癌中有功能的miRNA,其中15種抑制遷移,7種促進(jìn)遷移,在抑制遷移的miRNA中,相對于對照組,miR-451的差異倍數(shù)最低。結(jié)論:在待選miRNA中,miR-451明顯影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為。第二部分:胃癌組織及胃癌細(xì)胞系中miR-451的表達(dá)目的:檢測miR-451在胃癌組織及其配對的癌旁正常組織中的表達(dá)差異。檢測miR-451在正常胃黏膜上皮細(xì)胞株及三種胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)量。方法:收集20例胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本,利用RT-q PCR檢測miR-451在胃癌組織及其配對的癌旁正常組織中的表達(dá)差異情況。提取GES-1、BGC-823、HGC-27、SGC7901細(xì)胞株中的RNA,用實時熒光定量PCR檢測miR-451的表達(dá)。結(jié)果:1 miR-451在癌組織中的表達(dá)顯著低于配對的癌旁正常組織。2 miR-451在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)低于正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1。結(jié)論:miR-451在胃癌中表達(dá)下調(diào),提示其可能在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。第三部分:miR-451對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響目的:研究miR-451對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移、侵襲、EMT等生物學(xué)行為的影響。方法:應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將miR-451轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株以獲得高表達(dá)的miR-451的細(xì)胞模型,并用RT-q PCR驗證轉(zhuǎn)染效果;然后用CCK-8方法及EDU方法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖情況,用Annexin V/PI雙染通過流式細(xì)胞儀檢測凋亡,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化,用transwell試驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲,通過免疫熒光檢測細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadherin)和間充質(zhì)標(biāo)志物(vimentin)的表達(dá),來反映EMT過程。結(jié)果:1選擇SGC-7901細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型,利用Real-time q PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-451 mimics和陰性對照48h后miR-451的表達(dá),結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-451 mimics后SGC-7901細(xì)胞中miR-451的表達(dá)水平較陰性對照組顯著增高(P0.01)。2 CCK8方法和EDU方法均提示在胃癌細(xì)胞SGC-7901中,miR-451表達(dá)水平的上調(diào)可抑制細(xì)胞增殖。3流式細(xì)胞儀分析雙染Annexin V和PI的SGC-7901細(xì)胞凋亡比例,結(jié)果顯示:miR-451 mimics實驗組的凋亡細(xì)胞比例為21.36%,而陰性對照組有6.87%的細(xì)胞發(fā)生了凋亡,表明miR-451可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,結(jié)果示:miR-451 mimics實驗組的G1/G0期、S期和G2/M期的比例分別為55.31%、21.62%和19.89%,而陰性對照組三期的比例分別為45.76%、22.97%和26.87%,表明miR-451表達(dá)水平的上調(diào)可阻滯細(xì)胞于G1期。5用transwell遷移實驗檢測過表達(dá)miR-451對SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果示:miR-451 mimics實驗組遷移細(xì)胞數(shù)為(343.3±6.6)個,而陰性對照組為(520.6±7.6)個,兩組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。表明miR-451可以抑制胃癌細(xì)胞遷移。6用transwell侵襲實驗檢測過表達(dá)miR-451對SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的影響,結(jié)果示:miR-451 mimics實驗組侵襲細(xì)胞數(shù)為(373.3±7.6)個,而陰性對照組為(523.3±13.3)個,兩組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。表明miR-451可以抑制胃癌細(xì)胞侵襲。7和陰性對照組相比,miR-451 mimics實驗組中E-cadherin的表達(dá)增高,vimentin的表達(dá)降低,表明miR-451可以起到抑制EMT過程的作用。結(jié)論:miR-451在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用,影響胃癌的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。第四部分:miR-451靶基因的預(yù)測和驗證目的:尋找miR-451的靶基因,為深入研究miR-451的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對miR-451的靶基因進(jìn)行預(yù)測和篩選,利用雙熒光素酶報告基因方法驗證預(yù)測的靶基因,運(yùn)用RT-q PCR和western blot檢測過表達(dá)miR-451后ERK2分別在m RNA和蛋白水平表達(dá)的變化。結(jié)果:1應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對miR-451的靶基因進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果示:ERK2可能為miR-451的靶基因。2雙熒光素酶報告基因方法證明miR-451可以靶向作用于ERK2的3’UTR。3 RT-q PCR和western blot證明SGC-7901細(xì)胞過表達(dá)miR-451后,ERK2在m RNA和蛋白水平的表達(dá)均下調(diào)。結(jié)論:在胃癌中,ERK2是miR-451的下游靶基因。第五部分:沉默ERK2對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響目的:研究miR-451的下游靶基因ERK2對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移、侵襲、EMT等生物學(xué)行為的影響,分析miR-451是否是通過ERK2影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為。方法:首先合成ERK2的si RNA,分別用實時熒光定量PCR和western blot在m RNA和蛋白水平驗證其沉默效率,應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)入SGC-7901胃癌細(xì)胞以獲得低表達(dá)的ERK2細(xì)胞模型,然后用CCK-8方法及EDU方法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖情況,用Annexin V/PI雙染通過流式細(xì)胞儀檢測凋亡,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化,用transwell試驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲,通過免疫熒光檢測細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadherin)和間充質(zhì)標(biāo)志物(vimentin)的表達(dá),來反映EMT過程。結(jié)果:1 RT-q PCR和Western blot結(jié)果示:轉(zhuǎn)染ERK2 si RNA后,ERK2在m RNA水平和蛋白水平的表達(dá)較陰性對照組均顯著降低。2 CCK8方法和EDU方法均提示在胃癌細(xì)胞SGC-7901中,沉默ERK2可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖。3流式細(xì)胞儀分析雙染Annexin V和PI的SGC-7901細(xì)胞凋亡比例,結(jié)果顯示:si-ERK2實驗組的凋亡細(xì)胞比例為13.96%,而陰性對照組有6.87%的細(xì)胞發(fā)生了凋亡,表明下調(diào)ERK2的表達(dá)可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,結(jié)果示:si-ERK2實驗組的G1/G0期、S期和G2/M期的比例分別為55.29%、21.73%和19.11%,而陰性對照組三期的比例分別為45.76%、22.97%和26.87%,表明下調(diào)ERK2的表達(dá)可阻滯細(xì)胞于G1期。5用transwell遷移實驗檢測沉默ERK2對SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果示:si-ERK2實驗組遷移細(xì)胞數(shù)為(454±12.0)個,而陰性對照組為(520.6±7.6)個,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。表明ERK2表達(dá)水平的下調(diào)可以抑制胃癌細(xì)胞遷移。6用transwell侵襲實驗檢測沉默ERK2對SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的影響,結(jié)果顯示:si-ERK2實驗組侵襲細(xì)胞數(shù)為(410.7±24.1)個,而陰性對照組為(523.3±13.3)個,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。表明ERK2表達(dá)水平的下調(diào)可以抑制胃癌細(xì)胞侵襲。7和陰性對照組相比,si-ERK2實驗組中E-cadherin的表達(dá)增高,vimentin的表達(dá)降低,表明沉默ERK2可以起到抑制EMT過程的作用。結(jié)論:miR-451通過調(diào)控癌基因ERK2影響胃癌的生物學(xué)行為。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2445470