【摘要】：非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)是一組淋巴組織惡性增殖性疾病,也血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。NHL的發(fā)病率及死亡率均位居惡性腫瘤前10位,且發(fā)病率以平均每年增加5%的速度增長。世界衛(wèi)生組織(World health organization,WHO)將NHL分為不同類型,主要包括B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤和T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤,少數(shù)為NK細(xì)胞淋巴瘤。NHL是一種高度異質(zhì)性的疾病,其在分子病理、診斷、治療及個體化預(yù)后分層等方面的表現(xiàn)均有較大差異。因此,準(zhǔn)確的預(yù)后分層和規(guī)范的個體化治療是提高NHL療效的關(guān)鍵。隨著生物靶向治療和細(xì)胞免疫治療的開展,NHL患者的5年生存率已得到明顯提高,大部分患者的病情可以得到長期控制,但仍有約30%～40%的NHL患者因初始治療無效或緩解后早期復(fù)發(fā)而不能治愈,這部分患者即使接受包括異基因造血干細(xì)胞移植等在內(nèi)的挽救性治療也很難獲得長期生存。臨床亟待更加精確的預(yù)后分層及更為有效的個體化靶向治療方案來改善NHL的預(yù)后。研究表明,NHL的發(fā)生發(fā)展與生物分子異常表達及信號通路異�；罨芮杏嘘P(guān)。因此,深入研究NHL發(fā)生發(fā)展相關(guān)的特異性分子標(biāo)志物及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,探討NHL的發(fā)病機制,將為完善NHL的精確預(yù)后分層及個體化靶向治療提供理論基礎(chǔ),進而使NHL獲得更高的完全緩解率和長期存活率。Klotho是近來發(fā)現(xiàn)的獨立的抗衰老基因,可以調(diào)節(jié)鈣磷代謝、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)鈣離子通道,在衰老及衰老相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用。隨著近年來對其研究的深入,發(fā)現(xiàn)其與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Klotho的抗腫瘤作用于2008年在乳腺癌中首次被發(fā)現(xiàn)。越來越多的研究表明Kloho在宮頸癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌等多種實體瘤中表達下調(diào),并可作為疾病預(yù)后的獨立危險因素。在這些腫瘤中,Klotho通過調(diào)控多個信號通路,如胰島素樣生長因子-1 受體(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)信號通路、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)信號通路及Wnt/β-catenin信號通路等,參與腫瘤的發(fā)生、侵襲、遷移及耐藥,研究表明,NHL中亦存在上述信號通路的異�；罨Ｈ欢�,Klotho在NHL中的作用及相關(guān)分子機制目前尚未見報道。本研究以Klotho在NHL中的作用及機制為主要方向,探討Klotho在NHL中的表達水平,深入研究Klotho在NHL發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)作用機制,為NHL的診斷、預(yù)后評估及新型生物靶向治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。第一部分Klotho調(diào)控IGF-1R信號通路在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的作用及機制研究目的:彌漫大 B 細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人 NHL中最常見的一種亞型,占非霍奇金淋巴瘤所有初治病例種類的40%。DLBCL具有高度侵襲性,在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)及臨床預(yù)后方面存在高度異質(zhì)性。盡管以利妥昔單抗為代表的新型生物靶向治療及免疫細(xì)胞治療使大多數(shù)DLBCL患者的治療效果顯著提高,但仍有約1/3的患者初治耐藥或緩解后復(fù)發(fā)而不能治愈。DLBCL的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復(fù)雜過程,盡管目前已做了大量研究,但其病因及發(fā)病機制仍不清楚。Klotho在多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用,可以通過介導(dǎo)多種信號通路的活化調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移,與腫瘤細(xì)胞的分化程度、不良預(yù)后等密切相關(guān)。本研究旨在探討Klotho在DLBCL中的表達水平,分析其對DLBCL細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,并進一步研究Klotho參與DLBCL發(fā)生發(fā)展的作用機制。材料與方法:1.病例選擇及標(biāo)本收集;2.免疫組織化學(xué)染色;3.細(xì)胞培養(yǎng);4.外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)的分離;5.CD19+B細(xì)胞的分選及純度檢測;6.實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);7.蛋白提取及免疫印跡;8.Klotho過表達慢病毒轉(zhuǎn)染DLBCL細(xì)胞株;9.CCK-8檢測細(xì)胞增殖;10.Annexin V-PE/7AAD法檢測細(xì)胞凋亡;11.酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)檢測血清Klotho蛋白水平;12.DLBCL動物模型體內(nèi)檢測Klotho對DLBCL生長的影響;13.統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,納入的50例DLBCL患者標(biāo)本中,Klotho陽性表達率僅為14%(7/50例),顯著低于Klotho在對照組(反應(yīng)性淋巴結(jié)炎)的陽性表達率(80%,16/20例)。對DLBCL患者的臨床資料進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),Ⅲ/Ⅳ期DLBCL患者的Klotho表達水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期DLBCL患者的Klotho表達水平(p=0.002)。Kaplan-Meier生存分析顯示,Klotho高表達的患者生存期明顯長于Klotho低表達患者的生存期(p0.05)。我們檢測了DLBCL細(xì)胞株(LY1、LY8)中Klotho的mRNA及蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,Klotho的mRNA及蛋白水平均明顯降低。2.采用Klotho過表達慢病毒(LV-KL)及陰性對照慢病毒(LV-Con)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LY1、LY8細(xì)胞。與轉(zhuǎn)染LV-Con的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染LV-KL的DLBCL細(xì)胞增殖活性明顯降低(p0.01),轉(zhuǎn)染LV-Con的細(xì)胞增殖活性較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖活性無明顯差異。與對照組相比,皮下接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-KL的LY1細(xì)胞的SCID小鼠DLBCL生長的速度及體積明顯減低(p0.01)。此外,轉(zhuǎn)染LV-KL組小鼠腫瘤組織中Klotho的表達水平較對照組顯著增加,Ki67陽性率較對照組明顯降低。3.采用流式細(xì)胞術(shù)通過Annexin V-PE/7AAD染色法檢測發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染LV-Con組相比,轉(zhuǎn)染LV-KL可以明顯促進LY1細(xì)胞凋亡(6.56±0.71%vs.16.41 土2.16%,p0.01)及 LY8 細(xì)胞凋亡(7.23±0.65%vs.16.03±1.85%,p0.01)。此外,Klotho過表達可以抑制Mcl-1的表達,促進Cleaved-Caspase-3的表達增加。4.IGF-1對轉(zhuǎn)染LV-KL的LY1、LY8細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖水平明顯低于轉(zhuǎn)染LV-Con組(p0.05)。Klotho過表達可顯著抑制DLBCL細(xì)胞中IGF-1R及下游AKT、ERK1/2的磷酸化。過表達Klotho的DLBCL移植瘤小鼠腫瘤組織中IGF-1R、AKT、ERK1/2的磷酸化水平較對照組顯著降低。5.加入外源性Klotho蛋白,即重組Klotho(rhKL),可以使LY1及LY8細(xì)胞的增殖能力明顯降低(p0.05)。此外,rhKL可以增強LY1及LY8細(xì)胞對阿霉素(Adriamycin,ADR)的敏感性。體內(nèi)實驗證實,rhKL處理組DLBCL小鼠的腫瘤體積顯著小于空白對照組(p0.05)。將小鼠DLBCL腫瘤組織進行免疫組化染色顯示,與對照組相比,rhKL處理組小鼠腫瘤組織中Ki67陽性率明顯降低。說明rhKL可以在體內(nèi)發(fā)揮抑制DLBCL生長的作用。ELISA法檢測30例初治DLBCL患者及15例健康志愿者(對照組)血清分泌型Klotho蛋白濃度顯示,DLBCL患者中分泌型Klotho濃度明顯低于對照組(p0.05)。結(jié)論:上述研究證實,Klotho在DLBCL組織及多種細(xì)胞株中表達顯著下調(diào)。Klotho的表達水平與DLBCL患者的臨床分期、預(yù)后明顯相關(guān)。慢病毒介導(dǎo)Klotho過表達可以在體外、體內(nèi)抑制DLBCL細(xì)胞的增殖活性,Klotho高表達可以降低DLBCL腫瘤組織中Ki67的陽性率。Klotho過表達可以誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞凋亡、調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達。Klotho過表達可以抑制DLBCL中IGF-R及其下游靶分子AKT、ERK1/2的磷酸化,抑制IGF-1R信號通路的活化。外源性Klotho蛋白可以作為活性形式在體外、體內(nèi)發(fā)揮抑制DLBCL細(xì)胞生長的作用。本研究結(jié)果將為DLBCL的發(fā)病機制研究、精確預(yù)后評估及特異性靶向治療提供新的理論依據(jù)。第二部分Klotho在T細(xì)胞淋巴瘤中的生物學(xué)作用及機制研究目的:T細(xì)胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)是來源于T淋巴細(xì)胞的一種惡性克隆增殖性疾病,其發(fā)病地域差異較大,在我國較歐美國家常見。T細(xì)胞淋巴瘤具有高度侵襲性,目前尚缺乏確切的隨機多中心的化療及移植相關(guān)的臨床研究結(jié)果,大部分患者對化療敏感性低,最終難治、復(fù)發(fā),預(yù)后明顯差于B細(xì)胞淋巴瘤。研究證實抗衰老基因Klotho可以通過調(diào)控IGF-1R信號通路抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長。然而Klotho在T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。本研究旨在探討Klotho在T細(xì)胞淋巴瘤中的表達水平及對T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,進一步研究Klotho在T細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)揮作用的相關(guān)機制。材料與方法:1.病例選擇與標(biāo)本收集;2.免疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemistry,IHC);3.細(xì)胞培養(yǎng);4.外周血單個核細(xì)胞的分離;5.實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);6.蛋白提取及免疫印跡;7.Klotho過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞;8.CCK-8檢測細(xì)胞增殖;9.AnnexinV-PE/7AAD法檢測細(xì)胞凋亡;10.細(xì)胞免疫熒光;11.統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:1.免疫組織化學(xué)染色法檢測Klotho蛋白在35例初診T細(xì)胞淋巴瘤患者組織石蠟切片中的表達水平,同時使用20例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織作為對照。在反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織中,Klotho的陽性表達率為75%(15/20),而在T細(xì)胞淋巴瘤組織中Klotho陽性表達率僅為14.3%(5/35)。T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中Klotho的mRNA表達水平及蛋白表達水平均較正常對照細(xì)胞減低。2.采用Klotho過表達慢病毒及陰性對照病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株后,RT-PCR證實轉(zhuǎn)染LV-KL組細(xì)胞Klotho的mRNA表達水平顯著高于對照組(p0.01)。與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染LV-KL組的細(xì)胞增殖水平顯著降低(p0.05),轉(zhuǎn)染LV-Con組細(xì)胞的增殖水平較未轉(zhuǎn)染組無明顯變化。3.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),在T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(Jurkat、Karpas299)中,轉(zhuǎn)染LV-KL組細(xì)胞的凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染LV-Con組(p0.05)。與對照組相比,轉(zhuǎn)染LV-KL組T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中Mcl-1及Pro-Caspase-3蛋白表達水平顯著降低。4.IGF-1處理可以增強T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖活性,但是對轉(zhuǎn)染LV-KL的T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖活性的誘導(dǎo)作用低于轉(zhuǎn)染LV-Con組。在轉(zhuǎn)染LV-KL的T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中,IGF-1R及其下游AKT、ERK1/2的磷酸化水平均明顯下降。結(jié)論:上述研究證實,Klotho在T細(xì)胞淋巴瘤組織及多種T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中表達降低。過表達Klotho可以抑制T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖活性,誘導(dǎo)T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的凋亡,并調(diào)控T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Mcl-1、Pro-Caspase-3的表達。Klotho可以抑制T細(xì)胞淋巴瘤中IGF-1R信號通路的活化。提示Klotho有望作為T細(xì)胞淋巴瘤的新的生物標(biāo)志物及治療靶點,為提高T細(xì)胞淋巴瘤的療效提供新的治療策略。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.1

【參考文獻】

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1 甘麗虹;潘潔;陳淑潔;鐘菁;王良靜;;結(jié)直腸癌ZIC1和KLOTHO基因啟動子甲基化檢測的臨床價值初探[J];浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年03期

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本文編號：2445273