【摘要】：研究背景胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一,其發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、手術(shù)切除率低、放化療效果不佳,預(yù)后極差,總體5年生存率不到5%,在全球癌癥發(fā)病率中占第13位,排在所有惡性腫瘤致死原因的第四位。大多數(shù)的胰腺癌患者往往確診時(shí)已出現(xiàn)淋巴或血運(yùn)轉(zhuǎn)移,從而失去了根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。胰腺癌患者死亡的主要原因是腫瘤早期即發(fā)生局部侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,也是制約患者預(yù)后的主要因素。目前胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確,了解胰腺癌的惡性生物學(xué)行為發(fā)生機(jī)制,并給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施,對(duì)于提高胰腺癌的臨床診治水平并改善患者的預(yù)后具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)篩選最佳的預(yù)后標(biāo)志物,對(duì)于臨床醫(yī)師選擇恰當(dāng)?shù)闹委煼桨?避免不必要的治療帶來(lái)的毒副作用,具有一定的臨床指導(dǎo)意義。Bit1 (Bcl-2 inhibitor of transcription 1)是2004年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與細(xì)胞失巢凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì),其正常定位于線粒體內(nèi)膜,目前其確切生理功能尚未完全清楚。初期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)失偶聯(lián)即受到失黏附信號(hào)刺激時(shí),Bitl蛋白從線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞胞漿中,拮抗胞質(zhì)中的TLE1蛋白,并通過(guò)與胞漿中的轉(zhuǎn)錄共調(diào)解因子AES(amino-terminal enhancer of split)蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)復(fù)合物,啟動(dòng)一種特殊的凋亡形式,即非caspase(半胱氨酸蛋白酶)途徑依賴(lài)的凋亡。目前研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的失巢凋亡抵抗與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān),其中腫瘤細(xì)胞的EMT (Epithelial-MesenchymalTransition)過(guò)程在其中起著至關(guān)重要的作用。鑒于胰腺癌細(xì)胞的高侵襲性及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的特點(diǎn),了解Bitl蛋白與胰腺癌細(xì)胞失巢凋亡的相關(guān)性及對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響,并探討其對(duì)胰腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用機(jī)制,對(duì)于加深我們對(duì)胰腺癌分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)及尋找新的診斷或治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義。研究目的1.觀察Bitl蛋白在六株胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。2.探索Bitl蛋白對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響機(jī)制。3.探討B(tài)itl蛋白在胰腺癌病人組織中的表達(dá)情況以及與胰腺癌病人臨床病理特征的相關(guān)性及對(duì)預(yù)后的影響。方法：1. Western blot及Quantitative Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)六株胰腺癌細(xì)胞株中Bitl的基礎(chǔ)表達(dá)情況。通過(guò)慢病毒載體將Bit1的干擾的質(zhì)�；蜻^(guò)表達(dá)Bit1基因的質(zhì)粒分別導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1和Mia paca2細(xì)胞中,通過(guò)抗性篩選,建立穩(wěn)定沉默和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Bit1的胰腺癌細(xì)胞株。2.CCK8法檢測(cè)Bit1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖及化療敏感性的影響,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡,western blot檢測(cè)Bit1蛋白影響胰腺癌細(xì)胞增殖活性及化療敏感性的具體作用形式；利用Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bit1與胰腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系,western blot檢測(cè)其可能的作用機(jī)制。3.應(yīng)用western blot和免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)Bit1蛋白影響胰腺癌細(xì)胞惡性表型的相關(guān)機(jī)制。4.利用胰腺癌組織微陣列平臺(tái)結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)胰腺癌病人癌組織及癌旁組織中Bit1的表達(dá)情況,分析Bit1與胰腺癌病人臨床病理特征及胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：1.在實(shí)驗(yàn)室已驗(yàn)證的六株胰腺癌細(xì)胞株中,Panc-1胰腺癌細(xì)胞株在mRNA及蛋白水平的Bit1表達(dá)是最高的,而Mia paca2細(xì)胞的表達(dá)是最低的。以Panc-1及Mia paca2為親本株分別成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默以及過(guò)表達(dá)Bit1蛋白的胰腺癌細(xì)胞株。2.敲低Bit1的表達(dá)并未明顯影響胰腺癌Panc-1細(xì)胞株的增殖,但可抑制懸浮培養(yǎng)Panel細(xì)胞的凋亡,增加貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的化療敏感性并促進(jìn)其凋亡。然而,在胰腺癌Mia paca2細(xì)胞過(guò)表達(dá)Bit1蛋白后,胰腺癌Mia paca2細(xì)胞的增殖亦無(wú)明顯差異,但可增加懸浮培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞的凋亡比例,抑制貼壁培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞的化療敏感性并抑制其凋亡。Bit1敲減的胰腺癌Panel細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力明顯增強(qiáng),而過(guò)表達(dá)Bit1蛋白后胰腺癌Mia paca2細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力受到抑制。3. Western blot顯示Bit1通過(guò)影響caspase3、PARP、cleaved caspase3以及cleaved PARP的表達(dá)影響胰腺癌細(xì)胞的凋亡,并通過(guò)改變一系列上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過(guò)程相關(guān)蛋白的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲以及轉(zhuǎn)移能力。Bit1可能通過(guò)調(diào)控Erk通路的活性影響胰腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力。4. 對(duì)人胰腺癌組織微陣列切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bit1蛋白在胰腺癌病人癌旁組織的表達(dá)水平顯著高于癌組織(P0.05),且Bit1在胰腺癌組織中的表達(dá)水平與病人血清中的CEA水平以及神經(jīng)浸潤(rùn)有相關(guān)性(P0.05)。單因素生存分析顯示,飲酒、腫瘤分化程度、N分期、M分期和TNM分期與預(yù)后有相關(guān)性(p0.05),多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型提示飲酒、N1期、TNM分期中的Ⅲ-Ⅳ期是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P0.05)。結(jié)論：Bit1蛋白在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)存在明顯差異,Bit1對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響,但敲低Bit1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移,并影響其化療敏感性。Bit1蛋白可通過(guò)調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的EMT表型來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力,其過(guò)程可能與Erk通路的激活存在關(guān)聯(lián)性。Bit1蛋白在胰腺癌組織中低表達(dá),并與胰腺癌的神經(jīng)浸潤(rùn)密切相關(guān),Bit1蛋白可能與其他臨床指標(biāo)結(jié)合共同影響胰腺癌患者的預(yù)后。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.9

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本文編號(hào)：2445122