【摘要】：食管癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率占全球腫瘤發(fā)病率的第八位,死亡率占癌癥相關(guān)死亡率的第六位。我國(guó)食管癌發(fā)病率占世界首位,是食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)高發(fā)地區(qū),約占全球范圍內(nèi)的70%。近年來(lái),其發(fā)病率雖有所下降,但ESCC的長(zhǎng)期預(yù)后仍然較差,術(shù)后五年生存率只有15%～25%。DNA甲基化異常改變被認(rèn)為是ESCC發(fā)生發(fā)展的常見(jiàn)分子機(jī)制之一,主要特征是全基因組低甲基化和位點(diǎn)特異CpG島高甲基化。進(jìn)一步了解DNA異常甲基化如何調(diào)控ESCC的發(fā)生與發(fā)展,尋找ESCC甲基化異常改變分子標(biāo)志物,在指導(dǎo)人們對(duì)ESCC患者預(yù)后判斷以及制定有效治療方案等方面具有重要臨床意義。在本文的第一部分研究中,我們用簡(jiǎn)化的、具有代表性的DNA甲基化測(cè)序(RRBS)及基因表達(dá)譜芯片高通量分析技術(shù)分析了7例ESCC患者癌及其癌旁組織DNA甲基化水平和mRNA表達(dá)水平。先對(duì)ESCC和其癌旁差異甲基化基因進(jìn)行功能富集分析,差異基因主要功能富集在分子連接與調(diào)節(jié)、細(xì)胞組成與調(diào)節(jié)、催化活性與代謝調(diào)節(jié)等。另外,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞間相互作用相關(guān)基因發(fā)生較大改變。接著,結(jié)合前期表達(dá)譜芯片結(jié)果,篩出位于啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)基因。為了篩選ESCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中特異的甲基化改變基因,挑選前10個(gè)具有顯著差異的基因,結(jié)合功能和文獻(xiàn)檢索,篩選出甲基化升高同時(shí)表達(dá)降低基因Cyclin Y-like l(CCNYL1)進(jìn)行后續(xù)研究,經(jīng)過(guò)癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA)預(yù)測(cè)獲得其在ESCC中未有突變、缺失和擴(kuò)增等改變。進(jìn)一步我們用硫化測(cè)序PCR(BSP)技術(shù)在17對(duì)ESCC組織中驗(yàn)證DNA甲基化水平和Real-time PCR技術(shù)在10對(duì)冰凍ESCC組織中驗(yàn)證mRNA表達(dá)水平,結(jié)果與RRBS和表達(dá)譜芯片結(jié)果一致,CCNYL1在ESCC組織中呈高甲基化低表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,在ESCC中CCNYL1基因DMR處CpG位點(diǎn)13、CpG位點(diǎn)16、CpG位點(diǎn)17、CpG位點(diǎn)18和CpG位點(diǎn)19呈現(xiàn)高甲基化。與人食管上皮永生化細(xì)胞株相比,CCNYL1在ESCC細(xì)胞株中DNA甲基化水平顯著升高,mRNA表達(dá)水平降低。然后,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)在ESCC細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)CCNYL1基因,結(jié)果顯示其對(duì)癌細(xì)胞增殖有抑制作用。最后,我們采用表觀遺傳治療法,經(jīng)5-雜氮脫氧胞苷(5-aza-dC)處理ESCC細(xì)胞株后,CCNYL1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平降低,而mRNA表達(dá)升高,說(shuō)明甲基化直接調(diào)節(jié)CCNYL1的表達(dá)。另外DMR中CpG位點(diǎn)13、16、17和19甲基化水平顯著降低,為腫瘤治療提供分子基礎(chǔ)。所以,CCNYL1基因高甲基化可能參與ESCC的發(fā)生,其DMR可能為腫瘤治療提供新靶點(diǎn)。在本文第二部分的研究中,篩選前期高通量分析獲得ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中甲基化程度與表達(dá)水平負(fù)相關(guān)基因,DMR位于啟動(dòng)子區(qū)的差異基因共5個(gè),其中ODC1已在食管癌中有報(bào)道,PHB2、 PCMT1、 ARHGEF4在癌癥中也有許多研究,只有HSD11B1L研究較少,本部分重點(diǎn)研究HSD11B1L在ESCC發(fā)生發(fā)展中作用。經(jīng)驗(yàn)證HSD11B1L在ESCC組織及細(xì)胞株中DNA甲基化水平下降(P0.001),與mRNA表達(dá)成負(fù)相關(guān),并且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ESCC組織中,其甲基化水平低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織(P0.001)。另外,在ESCC細(xì)胞株中,敲降HSD11B1L影響其惡性程度,能抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力。為探索HSD11B1L甲基化頻率與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性,另外增加20例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和20例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的石蠟包埋ESCC組織用BSP檢測(cè)HSD11B1L甲基化水平,結(jié)果表明,HSD11B1L在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中甲基化水平低(P0.001),提示HSD11B1L甲基化水平低的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在癌組織中HSD11B1L的甲基化水平與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)性(P=0.039,P=0.004)。將ESCC組織進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析,得到的結(jié)果是HSD11B1L異常低甲基化的ESCC病人預(yù)后較差(P=0.003),多變量Cox回歸生存模型分析結(jié)果顯示HSD11B1L的甲基化是ESCC病人的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素(P=0.01)。所以,HSD11B1L異常低甲基化在ESCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。
[Abstract]:Esophageal cancer is one of the most common malignant tumors in the world. The incidence of esophageal cancer is the eighth of the global tumor incidence, and the mortality rate is the sixth of the cancer-related mortality. The incidence of esophageal cancer in China is the first in the world, and it is an area of high incidence of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), accounting for about 70% of the world. In recent years, the incidence of ESCC has decreased, but the long-term prognosis of ESCC is still poor. The five-year survival rate of ESCC is only 15% ~ 25%. The abnormal changes of DNA methylation are considered one of the most common molecular mechanisms for the development of ESCC. The main features are the low methylation of the whole genome and the high methylation of the site-specific CpG island. It is of great significance to find out how to regulate and control the occurrence and development of ESCC, to find the change of molecular markers in ESCC methylation, and to guide people to judge the prognosis of ESCC and to develop effective treatment plan. In the first part of this paper, we used a simplified, representative DNA methylation sequencing (RRBS) and high-throughput analysis of gene expression profiles to analyze the level of DNA methylation and the level of mRNA expression in 7 ESCC patients and their adjacent tissues. The functional enrichment analysis of the differentially methylated genes of ESCC and its adjacent cancer is carried out. The main function of the differential gene is the molecular connection and regulation, the composition and regulation of the cells, the catalytic activity and the regulation of metabolism, etc. In addition, there is a great change in cell movement, material transport, and inter-cell interaction-related genes. Then, the DNA methylation of the promoter region and the gene expression level were negatively correlated with the results of the earlier expression spectrum chip. In order to screen the specific methylation change gene in the development of ESCC, the first ten genes with significant difference, combined with function and literature search, were selected to screen out the simultaneous expression of the reduced gene Cyclin Y-like l (CCNYL1). A cancer genomic map database (TCGA) was used to predict the absence of mutation, deletion and amplification in ESCC. Further, we validated the level of DNA methylation and the real-time PCR in the ESCC tissue using a vulcanization sequencing PCR (BSP) technique to verify the level of mRNA expression in the 10-to-frozen ESCC tissue, and the results were consistent with the results of the RRBS and the expression profile, and the CCNYL1 was highly methylated and low in the ESCC tissue. By statistical analysis, the CpG sites 13, the CpG sites 16, the CpG sites 17, the CpG sites 18, and the CpG sites 19 of the CCNYL1 gene DMR were hypermethylated in the ESCC. Compared with the immortalized cell line of human esophageal epithelium, the level of DNA methylation of CCNYL1 in the ESCC cell line was significantly increased and the level of mRNA expression was decreased. Then, the CCNYL1 gene is overexpressed in the ESCC cell strain by in vitro experiment, and the result shows that the CCNYL1 gene has the inhibition effect on the proliferation of the cancer cells. Finally, we used epigenetic therapy to reduce the level of DNA methylation in the promoter region of the CCNYL1 gene, and the expression of the mRNA was increased, indicating the direct regulation of the expression of the CCNYL1. In addition, that methylation level of the CpG sites 13,16,17 and 19 in the DMR is obviously reduce, and the molecular basis for tumor treatment is provided. Therefore, the high methylation of the CCNYL1 gene may be involved in the occurrence of ESCC, and its DMR may provide a new target for tumor therapy. In the second part of this paper, there was a negative correlation between the degree of methylation and the level of expression in the lymph node metastasis of the ESCC and the level of expression of the non-lymph node metastasis group in the early stage of screening, and the DMR in the promoter region was 5, among which ODC1 had been reported in the esophageal cancer, PHB2, PCMT1, ARHGEF4 also has a number of studies in the treatment of cancer, and only the ADuC11B1L is less research, and this part focuses on the role of B11B1L in the development of ESCC. The level of DNA methylation in ESCC and cell lines decreased (P 0.001) and negative correlation with the expression of mRNA, and the methylation level was lower in the ESCC of the lymph node metastasis than that of the non-lymph node metastasis (P 0.001). In addition, in the ESCC cell line, the knock-down antigen 11B1L affects the degree of malignancy and can inhibit the proliferation and the invasion ability of the cell. In order to explore the correlation between the methylation frequency and the clinical pathological parameters of B11B1L,20 cases of lymph node metastasis and 20 paraffin-embedded ESCC tissues with no lymph node metastasis were used to detect the methylation level of B11B1L. The results showed that the methylation level of B11B1L in the lymph node metastasis was low (P 0.001). It is suggested that the patients with low methylation level of the CYP11B1L can be more easily transferred. The methylation level of p11B1L in cancer tissues was associated with the degree of tumor differentiation and lymph node metastasis (P = 0.039, P = 0.004). The results of the Kaplan-Meier survival analysis of ESCC were poor (P = 0.003), and the analysis of multivariate Cox regression survival model showed that the methylation of B11B1L was an independent prognostic factor for ESCC patients (P = 0.01). Therefore, the abnormal low methylation of P11B1L plays an important role in the development of ESCC and is an independent prognostic factor.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2436916