發(fā)布時(shí)間：2019-03-05 13:04

【摘要】：Cecropins是Boman等人首次從惜古比天蠶(Hyatophora cecropia)中提取出來(lái)的一類(lèi)抗菌肽家族,目前已發(fā)現(xiàn)的cecropins達(dá)20多種。Cecropins家族具有形成特定兩親性α-螺旋的能力,因此它們可針對(duì)非極性脂質(zhì)的細(xì)胞膜并在微摩爾濃度下對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有強(qiáng)烈的抗菌活性。已有文獻(xiàn)證明cecropins可抑制多種腫瘤細(xì)胞系如白血病、肝癌、膀胱癌和胃癌等的增殖但不損傷正常細(xì)胞,這一特點(diǎn)使得cecropins有望成為新一代的抗腫瘤藥物。本研究采用實(shí)驗(yàn)室前期從新疆家蠶Bombyx mori體內(nèi)獲得的抗菌肽基因,通過(guò)Saccharomyces cerevisiae真核表達(dá)獲得新疆家蠶抗菌肽(CecropinXJ)。CecropinXJ是一種含有37個(gè)氨基酸的小分子陽(yáng)離子抗菌肽,分子質(zhì)量為3.9 kDa,等電點(diǎn)為10.37,所編碼的氨基酸序列與已報(bào)道的cecropin B序列同源性達(dá)到98%,具有兩親性α-螺旋區(qū)域。實(shí)驗(yàn)研究表明,CecropinXJ可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖,并且能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,然而其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚。本研究采用MTT法檢測(cè)CecropinXJ對(duì)3株人胃癌細(xì)胞及人胃粘膜上皮正常細(xì)胞增殖的影響,篩選出敏感株人胃癌BGC823細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)、外抗腫瘤活性及其相關(guān)機(jī)制研究。通過(guò)MTT和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)觀察CecropinXJ對(duì)BGC823細(xì)胞體外增殖和生長(zhǎng)的影響,流式細(xì)胞儀檢測(cè)BGC823細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況,透射電鏡、倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;建立裸鼠BGC823荷實(shí)體瘤和Balb/c惡性腹水瘤模型,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療學(xué)觀察。采用腫瘤體積、瘤重、小鼠體重等指標(biāo),觀察CecropinXJ對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng),通過(guò)病理組織學(xué)觀察腫瘤組織和小鼠臟器的病理變化,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)、western blot和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白、PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白和血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,探討CecropinXJ的抗腫瘤作用機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:1、CecropinXJ體外能顯著抑制人胃癌BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)并通過(guò)激活線(xiàn)粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MTT和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)表明CecropinXJ抑制BGC823細(xì)胞的增殖和降低其集落形成能力,具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性,但對(duì)GES-1細(xì)胞無(wú)明顯的抑制增殖作用。CecropinXJ可通過(guò)阻滯BGC823細(xì)胞周期在S期進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀和形態(tài)學(xué)觀察顯示CecropinXJ誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CecropinXJ可引起細(xì)胞內(nèi)活性氧增加,線(xiàn)粒體膜電位下降。qRT-PCR和western blot結(jié)果表明CecropinXJ能夠引起B(yǎng)cl-2表達(dá)下調(diào),Bax表達(dá)上調(diào),促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放并活化caspase。CecropinXJ增加caspase-3/8/9活性呈劑量依賴(lài),經(jīng)caspase-3和caspase-9特異性抑制劑處理后可降低CecropinXJ介導(dǎo)的BGC823細(xì)胞死亡率。這些結(jié)果表明CecropinXJ體外能顯著抑制人胃癌BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)并通過(guò)激活線(xiàn)粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2、CecropinXJ單獨(dú)和與LY294002聯(lián)合使用通過(guò)作用PI3K/Akt通路抑制胃癌BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)。CecropinXJ抑制Akt的磷酸化水平阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路,進(jìn)而通過(guò)下調(diào)Bad磷酸化、升高下游促凋亡蛋白的表達(dá)和降低抗凋亡蛋白的表達(dá)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)。與LY294002聯(lián)用后,可增強(qiáng)CecropinXJ對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的阻斷作用,而且更能有效抑制BGC823細(xì)胞的體外生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。3、建立人胃癌Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,探討CecropinXJ的體內(nèi)抗腫瘤活性及其對(duì)腫瘤血管生成的影響。結(jié)果顯示CecropinXJ對(duì)小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng)具有抑制作用。顯微鏡下可見(jiàn)CecropinXJ處理組腫瘤組織呈片狀壞死,細(xì)胞間質(zhì)變大。并且檢測(cè)到CecropinXJ處理可引起腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞凋亡。除此之外,CecropinXJ能夠抑制腫瘤組織和BGC823細(xì)胞中血管生成相關(guān)因子CD31、CD34、VEGF、bFGF和vWF的表達(dá)。這些結(jié)果表明CecropinXJ能夠明顯抑制人胃癌BGC823細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制血管生成。4、建立Balb/c荷瘤小鼠惡性腹水瘤模型,探討CecropinXJ腹腔內(nèi)注射對(duì)人胃癌惡性腹水瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果顯示與BSA對(duì)照組相比,CecropinXJ和阿霉素(Doxorubicin,Dox)均能抑制惡性腹水瘤的形成,縮小腫瘤在體內(nèi)的擴(kuò)散。CecropinXJ組和Dox組相比較,CecropinXJ能明顯提高荷瘤小鼠腹水中BGC823細(xì)胞的凋亡率,改善荷瘤小鼠的生存質(zhì)量。
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【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉紅玉;崔洪斌;;中國(guó)林蛙抗菌肽對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2007年08期

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本文編號(hào)：2434931