【摘要】：背景與目的胃癌在全世界范圍內(nèi)癌癥的死亡原因中排名第二位。作為一種最常發(fā)生的腫瘤,胃癌主要通過手術(shù)及聯(lián)合的化療等治療方式來提高患者的生存率。然而,多種藥物的耐藥是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不佳的主要原因。目前改良式或者新型的化療是作為解決藥物耐藥以及改善胃癌患者預(yù)后的研究重點(diǎn)。類黃酮,主要從植物或者水果中提取,具有多種生物活性,被廣泛的應(yīng)用于腫瘤的治療中。作為類黃酮的一種,從柑橘類水果中提取的柚皮素,在最近的研究中發(fā)現(xiàn)具有抗基因突變及抗腫瘤基因的作用。最新的研究表明,柚皮素能夠在各種類型的癌細(xì)胞中,包括表皮樣癌細(xì)胞,肝癌細(xì)胞,膀胱癌細(xì)胞,乳腺癌細(xì)胞,抑制癌細(xì)胞的生長,遷移,導(dǎo)致癌細(xì)胞生長周期的阻滯。然而,柚皮素在胃癌細(xì)胞中的抗癌活性目前未見報(bào)道。在各種腫瘤細(xì)胞中,抗凋亡蛋白Bcl-2的過度表達(dá),被普遍認(rèn)為與藥物的耐藥性以及不佳的預(yù)后相關(guān)。ABT-737, BH-3的小型模仿蛋白,具有Bcl-2的抑制作用,其抗癌的功能在肺癌,急性粒細(xì)胞白血病,多發(fā)性骨髓瘤,淋巴瘤中被廣泛研究。然而,ABT-737在胃癌細(xì)胞的作用也未必研究過。在本研究中,我們研究柚皮素和ABT-737在胃癌細(xì)胞中的聯(lián)合應(yīng)用的作用。結(jié)果顯示,柚皮素或者ABT-737單獨(dú)使用能夠有效抑制癌細(xì)胞的生長及集落形成,而兩種藥物的聯(lián)合使用進(jìn)一步提高了其對(duì)胃癌細(xì)胞系細(xì)胞SGC7901的抑制能力。同時(shí),由柚皮素和ABT-737介導(dǎo)的抑制作用與Akt和p53通路相關(guān)。資料與方法細(xì)胞培養(yǎng)和試劑人胃癌細(xì)胞系SGC7901被應(yīng)用于本次實(shí)驗(yàn)中,在含有10%的小牛血清,1%的谷氨酰胺以及抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)定為37℃,CO2濃度為5%。柚皮素和ABT-737分別訂購于美國Sigma公司和Selleck Chemicals�？贵w多聚ADP核糖聚合酶(PARP), p-Akt以及Akt抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH), Caspase-3,p53抗體以及HRP鏈接的抗兔IgG抗體購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞活性檢測柚皮素或者ABT-737對(duì)SGC7901細(xì)胞生長的作用用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢查(碧云天,中國)。首先,2000個(gè)細(xì)胞被培養(yǎng)在96孔板上,同時(shí)給予柚皮素或者ABT-737刺激48小時(shí)。之后給予細(xì)胞10μl WST-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。細(xì)胞數(shù)量通過450nm波長的全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測定。細(xì)胞的活性與對(duì)照組相比,并用直方圖顯示。所有細(xì)胞活性的檢測總共重復(fù)了3次,每次進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)500個(gè)SGC7901細(xì)胞被培養(yǎng)在6孔板上,用柚皮素或者ABT-737或者柚皮素聯(lián)合ABT-737刺激6天�？寺〖�(xì)胞用甲醛在室溫下固定15分鐘,隨后用結(jié)晶紫染色30分鐘。數(shù)量超過50個(gè)細(xì)胞的克隆組被用來定量并用直方圖顯示。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)共重復(fù)了3次,每次進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)。Western blots通過含有蛋白酶抑制劑符合劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,取得全細(xì)胞的裂解液。裂解液通過含有SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)染到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶孵育PVDF膜。洗膜后用相應(yīng)的一抗孵育,之后再次洗膜并用含HRP的二抗孵育。膜上的條帶用ECL試劑(碧云天,中國)顯影,并與暗室中攝像(Kodak, USA)。數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)通過T檢驗(yàn)以及單因素方差分析進(jìn)行計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)差在直方圖中顯不。結(jié)果柚皮素以及ABT-737抑制SGC7901細(xì)胞的活性鑒于柚皮素和ABT-737具有抗癌的能力,我們通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢測他們對(duì)SGC7901細(xì)胞生長的作用。柚皮素明顯抑制SGC7901細(xì)胞的生長,且呈劑量依賴關(guān)系。同時(shí),ABT-737也能夠抑制細(xì)胞活性并呈現(xiàn)出劑量依賴性。而柚皮素和ABT-737的聯(lián)合應(yīng)用則表現(xiàn)出對(duì)SGC7901細(xì)胞生長更加明顯的抑制作用。這些結(jié)果意味著柚皮素不僅可以抑制胃癌細(xì)胞的生長,而且這種抑制效應(yīng)能夠被ABT-737所增強(qiáng)。柚皮素以及ABT-737抑制SGC7901細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)由于之前的實(shí)驗(yàn)表明柚皮素以及ABT-737能夠抑制細(xì)胞的生長,接下來我們通過克隆形成實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證這種抑制能力。低密度的SGC7901細(xì)胞被種植在培養(yǎng)皿上,且用柚皮素以及ABT-737聯(lián)合或者單獨(dú)刺激6天。柚皮素或者ABT-737的單獨(dú)刺激能夠明顯降低細(xì)胞的克隆數(shù)量,大約40%。而柚皮素和ABT-737的聯(lián)合應(yīng)用卻能夠降低約90%的克隆數(shù)量。因此,SGC7901細(xì)胞的克隆形成能夠被柚皮素,ABT-737或者兩者的聯(lián)用所抑制。柚皮素以及ABT-737能夠誘導(dǎo)caspase-3以及PARP的表達(dá)柚皮素和ABT-737能夠在許多細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生,因此我們?cè)赟GC7901細(xì)胞中驗(yàn)證了這種誘導(dǎo)凋亡的能力。凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP在SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)通過Western blot來測定。柚皮素和ABT-737的單獨(dú)刺激能夠明顯提高caspase-3的活性形式cleaved caspase-3的表達(dá)以及PARP的表達(dá)。而柚皮素以及ABT-737的聯(lián)用則進(jìn)一步增強(qiáng)的這種誘導(dǎo)作用,cleaved caspase-3以及PARP的表達(dá)被進(jìn)一步提高,這也意味著柚皮素和ABT-737的聯(lián)用增強(qiáng)了SGC7901細(xì)胞的凋亡。柚皮素和ABT-737增加p53的表達(dá),降低Akt的活性柚皮素能夠通過多種途徑降低細(xì)胞的凋亡。而本此研究對(duì)柚皮素和ABT-737誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路也進(jìn)行了研究。p53和Akt是細(xì)胞凋亡和存活的重要調(diào)解通路。我們的結(jié)果表明,柚皮素明顯能夠明顯抑制Akt的磷酸化,而ABT-737卻不具備這種作用。SGC7901細(xì)胞中磷酸Akt的表達(dá)被柚皮素或者ABT-737顯著的降低。同時(shí),柚皮素和ABT-737都能夠提高p53蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果意味著p53和Akt通路在柚皮素和ABT-737介導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞凋亡的過程中起著重要的作用。結(jié)論1.柚皮素在胃癌細(xì)胞中具有抗癌的活性。2.ABT-737在胃癌細(xì)胞中具有抗癌的活性。3.柚皮素與ABT-737聯(lián)合應(yīng)用在胃癌細(xì)胞中的抗癌活性更強(qiáng)。4.柚皮素單獨(dú)使用或者與ABT-737聯(lián)合使用都能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞生長與克隆形成的抑制。5.柚皮素和ABT-737能夠誘導(dǎo)caspase-3以及PARP的活化,從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。6.Akt和p53通路參與柚皮素與ABT-737聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2434463