【摘要】：目的(1)明確ERα在人肺癌組織和A/J小鼠肺癌組織中的表現(xiàn);(2)證明ERα和CYP1B1參與NNK誘導的肺癌發(fā)生;(3)探討ERα促進NNK誘導肺癌發(fā)生的分子機制。方法首先:收集30例肺癌患者術后腫瘤和非腫瘤組織標本,用福爾馬林固定、石蠟包埋、切片,通過免疫組織化學染色觀察人肺組織中ERα的表達情況,對比肺癌患者正常肺組織和腫瘤組織中ERα蛋白表達情況。其次:利用單劑量NNK (100mg/kg)腹腔注射給藥的方式建立A/J小鼠肺癌模型,采用HE染色觀察該過程中小鼠肺腫瘤的生長情況,利用免疫組織化學染色對比NNK誘導組小鼠和對照組小鼠肺組織中ERα的表達,通過Western blot、real time-PCR分析,對比肺組織中ERα的蛋白及mRNA水平。簡要步驟如下:將160只6周齡清潔級A/J小鼠隨機分為2組,每組80只,每籠10只,分籠飼養(yǎng)。實驗組通過腹腔注射給予單劑量NNK (生理鹽水溶解);對照組僅給予同等體積生理鹽水。于NNK處理后第26周開始處死小鼠,每4周1次,每次10只,直至實驗結束。取小鼠肺組織,將左肺浸泡于福爾馬林溶液中固定、石蠟包埋、切片,制成5 μm厚切片用于免疫組織化學染色和HE染色;右肺保存于-80℃待提取核蛋白、總蛋白和總RNA,用于進行Western blot、real time-PCR和基因芯片等分析。第三:利用Western blot檢測NNK處理組小鼠肺組織中CYP1B1的表達變化,觀察其與ERα表達改變的相似度。通過基因芯片技術尋找在NNK誘導小鼠肺癌發(fā)生過程中與ERα、CYP1B1有關的信息,包括信號通路、基因網(wǎng)絡等。利用這些信息判定ERα和CYP1B1是否參與NNK誘導A/J小鼠肺癌的發(fā)生。最后:利用人非小細胞肺癌細胞株NCI-H23和NCI-H460探討ERα、CYP1B1在NNK誘導肺癌發(fā)生中的作用及分子機制。(a)細胞培養(yǎng):2株細胞均采用DMEM+10%FBS培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。根據(jù)實驗具體內(nèi)容采取不同分組及處理,主要干預因子包括NNK、U0126和siRNA。(b)通過Western blot分析和免疫熒光染色檢驗NNK處理后的細胞中CYP1B1、ERα蛋白表達變化,觀察其表現(xiàn)是否與NNK誘導的小鼠組織一致。(c)利用流式細胞術觀察ERα siRNA和CYP1B1 siRNA干預后細胞的凋亡情況,判定ERα、CYP1B1在NNK促進腫瘤細胞增殖中的作用。(d)通過Western blot分析,觀察NNK誘導及siRNA干擾雙重作用下細胞中CYP1B1、ERα的蛋白表達變化,判斷二者的調(diào)控關系。(e)采用Western blot分析檢測RAS/ERK/AP1信號通路相關蛋白在NNK誘導下的表達情況,觀察該信號通路是否參與NNK誘導的肺癌發(fā)生。檢測的蛋白包括:ERK、p-ERK、c-Fos、c-Jun、pdcd4、spry1、spry2和btg2。(f)利用Western blot分析檢測ERK特異性抑制劑(U0126)處理后細胞中相關蛋白的表達情況,驗證RAS/ERK/AP1信號通路參與NNK誘導肺癌發(fā)生。檢測的蛋白同(e)。同時,觀察ERα、CYP1B1、Bax、Bcl-2蛋白表達改變,進一步確認ERα CYP1B1在NNK促進腫瘤細胞增殖中的作用。(g)通過Western blot分析,觀察CYP1B1siRNA、ERα siRNA處理后RAS/ERK/AP1信號通路相關蛋白及抗凋亡相關蛋白的表達,分析ERα促進NNK誘導肺癌發(fā)生是否需要CYP1B1和ERK的活化。(h)畫出可能的調(diào)控圖。結果(1)從免疫組織化學染色結果看,人肺癌組織中ERα蛋白表達較癌旁正常組織顯著升高,且主要集中于細胞核;腫瘤組織中ERα表達平均分為3.5分,ERα表達陽性的細胞占41%-60%。(2) HE染色結果顯示,隨著NNK作用時間延長小鼠肺組織中腫瘤細胞比例增加,最后形成大面積的瘤體;免疫組織化學染色顯示,NNK處理組的ERα表達明顯高于對照組,且主要集中于細胞核中,這與在人肺癌組織中觀察到的現(xiàn)象一致,并且第26周至第54周腫瘤組織中ERα表達平均分為4.5分,陽性細胞比例占80%以上。Western blot結果顯示,與正常對照組相比,隨著NNK誘導時間的延長小鼠腫瘤組織中ERα蛋白水平逐漸升高,并一直高于對照組。ERα mRNA水平表達同樣隨NNK作用時間的延長呈上升趨勢,其中第30周、第34周差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。(3)Western blot檢測結果顯示,在NNK誘導的A/J小鼠肺癌發(fā)展過程中,CYP1B1表達明顯增加,并且CYP1B1表達增加的時間和趨勢部分與ERα變化重疊�；蛩綑z測顯示,NNK誘導第34周時的小鼠肺組織中ERα、CYP1B1編碼基因的水平分別較對照組增加8倍、6倍�；蛐酒盘柾贩治霭l(fā)現(xiàn),ERα、Cyp1b1共同參與了NNK誘導的小鼠肺癌發(fā)生,二者參與的信號通路共8條,其中包括ERK/MAPK信號通路。基因芯片網(wǎng)絡分析結果顯示,在NNK誘導的肺癌發(fā)生發(fā)展過程中有3個功能不同的高分值(15)基因網(wǎng)含有ERα和Cyp1b1,其中ERα和Cyp1b1同時參與藥物代謝和小分子生物化學反應。這與二者的生物學功能有關,也可能與NNK代謝有關。(4)(a)體外研究結果顯示,NNK處理后的NCI-H23、NCI-H460細胞中ERα、CYP1B1表達上調(diào),其中ERα主要在細胞核中表達,細胞核蛋白中ERα表達增幅較對照組高。該結果與在NNK處理的A/J小鼠肺組織及人肺腫瘤組織中所獲得的數(shù)據(jù)相符。(b)先轉染CYP1B1 siRNA和ERα siRNA后加NNK處理的NCI-H23、NCI-H460細胞凋亡率明顯上升,轉染了CYP1B1 siRNA的NCI-H460細胞凋亡率甚至高達80%。同時,經(jīng)過轉染CYP1B1 siRNA的細胞與沒轉染的對照組相比NNK導致的ERα上調(diào)受到明顯抑制,而轉染ERαsiRNA的細胞中CYP1B1幾乎無變化。說明,抑制CYP1B1表達可以減少ERα,但阻斷ERα的表達并不能削弱NNK對CYP1B1的影響。(c)分析ERK/MAPK信號通路相關蛋白表達情況發(fā)現(xiàn),NNK處理后NCI-H23、NCI-H460中p-ERK、c-Fos和c-Jun表達均明顯升高,并且c-Fos、c-Jun表達升高與p-ERK基本平行。與c-Fos、c-Jun不同,Ras/ERK/AP1多重負性調(diào)節(jié)因子pdcd4、spry1、spry2和btg2在NNK作用后總體呈時間依賴的下降趨勢。然而,ERK特異性抑制劑(U0126)預處理后再經(jīng)NNK作用的NCI-H23、NCI-H460相比單純NNK處理的細胞而言,c-Fos和c-Jun 表達降低,Pdcd4、Spry1、Spry2、Btg2表達升高。(d) Western blot分析發(fā)現(xiàn):與單純NNK處理組相比,U0126作用后NNK導致的ERα上調(diào)受到抑制,ERα表達降低;與ERα相反,U0126阻斷ERK后CYP1B1表達與單純NNK作用組相比有所升高。此結果與siRNA干擾后的結果相似。此外,U0126作用下,抗細胞凋亡蛋白Bcl-2表達降低,促凋亡蛋白Bax表達升高,細胞凋亡能力增加。綜上所述,ERα可保護腫瘤細胞防止細胞凋亡,該作用需要通過依賴CYP1B1和ERK活化。結論(1)ERα有助于肺癌的發(fā)生發(fā)展。(2)ERα、CYP1B1共同參與NNK誘導的肺癌發(fā)生。(3)ERα在促進NNK誘導肺癌發(fā)生時依賴CYP1B1和ERK活化。(4)抑制CYP1B1、ERK、ERα可以延緩肺癌細胞生長,可作為肺癌治療的潛在靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣東工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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