【摘要】：目的(1)明確ERα在人肺癌組織和A/J小鼠肺癌組織中的表現(xiàn);(2)證明ERα和CYP1B1參與NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生;(3)探討ERα促進(jìn)NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的分子機(jī)制。方法首先:收集30例肺癌患者術(shù)后腫瘤和非腫瘤組織標(biāo)本,用福爾馬林固定、石蠟包埋、切片,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察人肺組織中ERα的表達(dá)情況,對(duì)比肺癌患者正常肺組織和腫瘤組織中ERα蛋白表達(dá)情況。其次:利用單劑量NNK (100mg/kg)腹腔注射給藥的方式建立A/J小鼠肺癌模型,采用HE染色觀察該過(guò)程中小鼠肺腫瘤的生長(zhǎng)情況,利用免疫組織化學(xué)染色對(duì)比NNK誘導(dǎo)組小鼠和對(duì)照組小鼠肺組織中ERα的表達(dá),通過(guò)Western blot、real time-PCR分析,對(duì)比肺組織中ERα的蛋白及mRNA水平。簡(jiǎn)要步驟如下:將160只6周齡清潔級(jí)A/J小鼠隨機(jī)分為2組,每組80只,每籠10只,分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)腹腔注射給予單劑量NNK (生理鹽水溶解);對(duì)照組僅給予同等體積生理鹽水。于NNK處理后第26周開(kāi)始處死小鼠,每4周1次,每次10只,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。取小鼠肺組織,將左肺浸泡于福爾馬林溶液中固定、石蠟包埋、切片,制成5 μm厚切片用于免疫組織化學(xué)染色和HE染色;右肺保存于-80℃待提取核蛋白、總蛋白和總RNA,用于進(jìn)行Western blot、real time-PCR和基因芯片等分析。第三:利用Western blot檢測(cè)NNK處理組小鼠肺組織中CYP1B1的表達(dá)變化,觀察其與ERα表達(dá)改變的相似度。通過(guò)基因芯片技術(shù)尋找在NNK誘導(dǎo)小鼠肺癌發(fā)生過(guò)程中與ERα、CYP1B1有關(guān)的信息,包括信號(hào)通路、基因網(wǎng)絡(luò)等。利用這些信息判定ERα和CYP1B1是否參與NNK誘導(dǎo)A/J小鼠肺癌的發(fā)生。最后:利用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H23和NCI-H460探討ERα、CYP1B1在NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生中的作用及分子機(jī)制。(a)細(xì)胞培養(yǎng):2株細(xì)胞均采用DMEM+10%FBS培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體內(nèi)容采取不同分組及處理,主要干預(yù)因子包括NNK、U0126和siRNA。(b)通過(guò)Western blot分析和免疫熒光染色檢驗(yàn)NNK處理后的細(xì)胞中CYP1B1、ERα蛋白表達(dá)變化,觀察其表現(xiàn)是否與NNK誘導(dǎo)的小鼠組織一致。(c)利用流式細(xì)胞術(shù)觀察ERα siRNA和CYP1B1 siRNA干預(yù)后細(xì)胞的凋亡情況,判定ERα、CYP1B1在NNK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖中的作用。(d)通過(guò)Western blot分析,觀察NNK誘導(dǎo)及siRNA干擾雙重作用下細(xì)胞中CYP1B1、ERα的蛋白表達(dá)變化,判斷二者的調(diào)控關(guān)系。(e)采用Western blot分析檢測(cè)RAS/ERK/AP1信號(hào)通路相關(guān)蛋白在NNK誘導(dǎo)下的表達(dá)情況,觀察該信號(hào)通路是否參與NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生。檢測(cè)的蛋白包括:ERK、p-ERK、c-Fos、c-Jun、pdcd4、spry1、spry2和btg2。(f)利用Western blot分析檢測(cè)ERK特異性抑制劑(U0126)處理后細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,驗(yàn)證RAS/ERK/AP1信號(hào)通路參與NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生。檢測(cè)的蛋白同(e)。同時(shí),觀察ERα、CYP1B1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)改變,進(jìn)一步確認(rèn)ERα CYP1B1在NNK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖中的作用。(g)通過(guò)Western blot分析,觀察CYP1B1siRNA、ERα siRNA處理后RAS/ERK/AP1信號(hào)通路相關(guān)蛋白及抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),分析ERα促進(jìn)NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生是否需要CYP1B1和ERK的活化。(h)畫出可能的調(diào)控圖。結(jié)果(1)從免疫組織化學(xué)染色結(jié)果看,人肺癌組織中ERα蛋白表達(dá)較癌旁正常組織顯著升高,且主要集中于細(xì)胞核;腫瘤組織中ERα表達(dá)平均分為3.5分,ERα表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞占41%-60%。(2) HE染色結(jié)果顯示,隨著NNK作用時(shí)間延長(zhǎng)小鼠肺組織中腫瘤細(xì)胞比例增加,最后形成大面積的瘤體;免疫組織化學(xué)染色顯示,NNK處理組的ERα表達(dá)明顯高于對(duì)照組,且主要集中于細(xì)胞核中,這與在人肺癌組織中觀察到的現(xiàn)象一致,并且第26周至第54周腫瘤組織中ERα表達(dá)平均分為4.5分,陽(yáng)性細(xì)胞比例占80%以上。Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,隨著NNK誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)小鼠腫瘤組織中ERα蛋白水平逐漸升高,并一直高于對(duì)照組。ERα mRNA水平表達(dá)同樣隨NNK作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),其中第30周、第34周差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(3)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,在NNK誘導(dǎo)的A/J小鼠肺癌發(fā)展過(guò)程中,CYP1B1表達(dá)明顯增加,并且CYP1B1表達(dá)增加的時(shí)間和趨勢(shì)部分與ERα變化重疊�；蛩綑z測(cè)顯示,NNK誘導(dǎo)第34周時(shí)的小鼠肺組織中ERα、CYP1B1編碼基因的水平分別較對(duì)照組增加8倍、6倍。基因芯片信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn),ERα、Cyp1b1共同參與了NNK誘導(dǎo)的小鼠肺癌發(fā)生,二者參與的信號(hào)通路共8條,其中包括ERK/MAPK信號(hào)通路�；蛐酒W(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示,在NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有3個(gè)功能不同的高分值(15)基因網(wǎng)含有ERα和Cyp1b1,其中ERα和Cyp1b1同時(shí)參與藥物代謝和小分子生物化學(xué)反應(yīng)。這與二者的生物學(xué)功能有關(guān),也可能與NNK代謝有關(guān)。(4)(a)體外研究結(jié)果顯示,NNK處理后的NCI-H23、NCI-H460細(xì)胞中ERα、CYP1B1表達(dá)上調(diào),其中ERα主要在細(xì)胞核中表達(dá),細(xì)胞核蛋白中ERα表達(dá)增幅較對(duì)照組高。該結(jié)果與在NNK處理的A/J小鼠肺組織及人肺腫瘤組織中所獲得的數(shù)據(jù)相符。(b)先轉(zhuǎn)染CYP1B1 siRNA和ERα siRNA后加NNK處理的NCI-H23、NCI-H460細(xì)胞凋亡率明顯上升,轉(zhuǎn)染了CYP1B1 siRNA的NCI-H460細(xì)胞凋亡率甚至高達(dá)80%。同時(shí),經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染CYP1B1 siRNA的細(xì)胞與沒(méi)轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比NNK導(dǎo)致的ERα上調(diào)受到明顯抑制,而轉(zhuǎn)染ERαsiRNA的細(xì)胞中CYP1B1幾乎無(wú)變化。說(shuō)明,抑制CYP1B1表達(dá)可以減少ERα,但阻斷ERα的表達(dá)并不能削弱NNK對(duì)CYP1B1的影響。(c)分析ERK/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),NNK處理后NCI-H23、NCI-H460中p-ERK、c-Fos和c-Jun表達(dá)均明顯升高,并且c-Fos、c-Jun表達(dá)升高與p-ERK基本平行。與c-Fos、c-Jun不同,Ras/ERK/AP1多重負(fù)性調(diào)節(jié)因子pdcd4、spry1、spry2和btg2在NNK作用后總體呈時(shí)間依賴的下降趨勢(shì)。然而,ERK特異性抑制劑(U0126)預(yù)處理后再經(jīng)NNK作用的NCI-H23、NCI-H460相比單純NNK處理的細(xì)胞而言,c-Fos和c-Jun 表達(dá)降低,Pdcd4、Spry1、Spry2、Btg2表達(dá)升高。(d) Western blot分析發(fā)現(xiàn):與單純NNK處理組相比,U0126作用后NNK導(dǎo)致的ERα上調(diào)受到抑制,ERα表達(dá)降低;與ERα相反,U0126阻斷ERK后CYP1B1表達(dá)與單純NNK作用組相比有所升高。此結(jié)果與siRNA干擾后的結(jié)果相似。此外,U0126作用下,抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低,促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高,細(xì)胞凋亡能力增加。綜上所述,ERα可保護(hù)腫瘤細(xì)胞防止細(xì)胞凋亡,該作用需要通過(guò)依賴CYP1B1和ERK活化。結(jié)論(1)ERα有助于肺癌的發(fā)生發(fā)展。(2)ERα、CYP1B1共同參與NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生。(3)ERα在促進(jìn)NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生時(shí)依賴CYP1B1和ERK活化。(4)抑制CYP1B1、ERK、ERα可以延緩肺癌細(xì)胞生長(zhǎng),可作為肺癌治療的潛在靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣東工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2432854