【摘要】：本論文的研究內(nèi)容分為兩部分,第一部分對酪氨酸代謝酶HPD(羥苯丙酮酸二加氧酶)在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及作用機制進行了系統(tǒng)研究,第二部分在前期研究基礎(chǔ)上,深入探討了轉(zhuǎn)錄因子THAP11在造血分化中的作用機制。HPD是酪氨酸代謝中的一個關(guān)鍵酶,以往的研究表明HPD在肝臟及腎臟中特異表達,在其他組織中表達水平低或不表達。我們利用組織芯片檢測了HPD在355例肺癌病人中的表達水平,結(jié)果顯示HPD在肺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織,進一步利用ELISA和Western Blotting技術(shù)驗證了HPD在肺癌組織和細胞系的高表達。為探討HPD異常高表達對肺癌細胞惡性表型的影響,我們構(gòu)建了基于慢病毒的HPD過表達及HPD RNAi的肺癌穩(wěn)定細胞株,研究發(fā)現(xiàn)過表達HPD并不影響肺癌細胞的生長,但敲低HPD則顯著抑制肺癌細胞的生長與存活,并降低肺癌細胞體內(nèi)成瘤能力,表明HPD參與肺癌細胞生長和存活能力的調(diào)控。此外,過表達HPD促進多種肺癌細胞的遷移能力,敲低HPD則抑制肺癌細胞的遷移能力,并降低肺癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力,表明HPD過表達促進肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。我們還檢測了HPD對治療肺癌藥物敏感性的影響,結(jié)果顯示過表達HPD降低肺癌細胞對多種藥物的敏感性,而敲低HPD可導致肺癌細胞對藥物的敏感性增加,凋亡增多。另外,我們對HPD的作用機制進行初步探討,發(fā)現(xiàn)HPD的酶活性特異抑制劑Nitisinone對肺癌細胞增殖和遷移無明顯影響,提示HPD對肺癌細胞的影響并不依賴其代謝酶活性。根據(jù)前期研究基礎(chǔ),我們發(fā)現(xiàn)HPD促進肺癌細胞中NF-?B信號通路的活化,表現(xiàn)為HPD增加NF-кB報告基因活性,促進IкBα降解及p65入核,上調(diào)NF-кB下游靶基因如c-Myc、MMP9和CyclinD1等的表達,表明HPD可能通過促進NF-кB信號通路調(diào)控肺癌細胞存活、凋亡和遷移。THAP11是一種轉(zhuǎn)錄因子,可通過結(jié)合c-Myc啟動子下調(diào)c-Myc表達抑制細胞增殖,在增殖、胚胎發(fā)育及ES細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。我們前期的研究表明THAP11是一個新的調(diào)控紅系/巨核系分化的轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)控造血細胞向紅系和巨核系分化過程中發(fā)揮著重要的作用,但調(diào)控機制并不明確。我們對THAP11在造血分化中的作用機制進行深入研究,結(jié)果顯示在hemin誘導K562細胞向紅系分化過程中,THAP11過表達可導致紅系造血因子c-Myc下調(diào),巨核系造血因子Fli 1上調(diào)。THAP11在多種造血轉(zhuǎn)錄因子如GATA-2、c-Myb、Fli-1和c-Myc等的啟動子區(qū)存在結(jié)合位點,ChIP實驗證實THAP11與這些位點存在結(jié)合。在PMA誘導K562細胞向巨核系分化過程中,THAP11并不影響H3K9和H3K18的乙酰化水平。此外,我們還發(fā)現(xiàn)THAP11和GATA-2存在相互作用,相互作用結(jié)構(gòu)域在GATA-2的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū),提示THAP11很可能通過相互作用調(diào)控GATA-2活性。這些研究結(jié)果表明THAP11參與造血分化可能是紅系或巨核系相關(guān)基因進行整體調(diào)控的結(jié)果。
[Abstract]:The research contents of this thesis are divided into two parts. In the first part, the role and mechanism of tyrosine metabolizing enzyme HPD (hydroxyphenylketoate dioxygenase) in the carcinogenesis and development of lung cancer are studied systematically. The second part is based on the previous study. The mechanism of transcription factor THAP11 in hematopoiesis differentiation was investigated. HPD is a key enzyme in tyrosine metabolism. Previous studies have shown that HPD is specifically expressed in liver and kidney, but not expressed in other tissues. We detected the expression of HPD in 355 patients with lung cancer using tissue microarray. The results showed that the expression level of HPD in lung cancer tissues was significantly higher than that in non-cancerous tissues. Furthermore, ELISA and Western Blotting techniques were used to verify the high expression of HPD in lung cancer tissues and cell lines. In order to investigate the effect of abnormal high expression of HPD on malignant phenotype of lung cancer cells, we constructed a stable lung cancer cell line based on lentiviral HPD overexpression and HPD RNAi. It was found that overexpression of HPD did not affect the growth of lung cancer cells. However, knock-down of HPD significantly inhibited the growth and survival of lung cancer cells, and decreased the tumorigenicity of lung cancer cells in vivo, suggesting that HPD is involved in the regulation of growth and survival of lung cancer cells. In addition, over-expression of HPD promoted the migration of lung cancer cells, while down-regulation of HPD inhibited the migration of lung cancer cells and decreased the metastatic ability of lung cancer cells in vivo, indicating that over-expression of HPD promoted the invasion and metastasis of lung cancer cells. We also examined the effect of HPD on the drug sensitivity of lung cancer cells. The results showed that over-expression of HPD decreased the sensitivity of lung cancer cells to many kinds of drugs, and low HPD resulted in increased drug sensitivity and increased apoptosis of lung cancer cells. In addition, we investigated the mechanism of HPD and found that Nitisinone, a specific inhibitor of HPD enzyme activity, had no significant effect on the proliferation and migration of lung cancer cells, suggesting that the effect of HPD on lung cancer cells did not depend on its metabolic enzyme activity. On the basis of previous studies, we found that HPD promoted the activation of NF-?B signaling pathway in lung cancer cells, which showed that HPD increased the activity of NF- B reporter gene, promoted the degradation of I / B 偽 and the entry of p65 into the nucleus, and up-regulated the downstream target genes of NF- B, such as ccMyc. The expression of MMP9 and CyclinD1 suggests that HPD may regulate the survival, apoptosis and migration of lung cancer cells by promoting NF- B signaling pathway. THAP11 is a transcription factor, which can inhibit the proliferation of lung cancer cells by down-regulating the expression of c-Myc by binding to c-Myc promoter. Embryonic development and differentiation of ES cells play an important role. Our previous studies have shown that THAP11 is a new transcription factor regulating erythroid / megakaryocyte differentiation, which plays an important role in regulating the differentiation of hematopoietic cells into erythroid and megakaryocyte lines, but the regulatory mechanism is not clear. We studied the mechanism of THAP11 in hematopoiesis differentiation. The results showed that the overexpression of THAP11 could lead to down-regulation of erythroid hemopoietic factor c-Myc during the differentiation of K562 cells to erythroid induced by hemin. Megakaryocyte hemopoietic factor Fli-1 was up-regulated. THAP11 had binding sites in the promoter regions of various hematopoietic transcription factors, such as GATA-2,c-Myb,Fli-1 and c-Myc, and THAP11 binding to these sites was confirmed by ChIP assay. During the differentiation of K562 cells into megakaryocytes induced by PMA, THAP11 did not affect the acetylation level of H3K9 and H3K18. In addition, we also found that THAP11 and GATA-2 interact with each other, and the interaction domain is in the zinc finger domain of GATA-2, suggesting that THAP11 may regulate the activity of GATA-2 through the interaction. These results suggest that the involvement of THAP11 in hematopoietic differentiation may be the result of the whole regulation of erythroid or megakaryocyte-related genes.
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：2433237