發(fā)布時間：2019-02-27 16:59

【摘要】：目的:放療是肝癌治療過程中的重要環(huán)節(jié)之一,它能對癌細胞起到有力的殺傷作用,但是隨著放療次數(shù)的增多,可能會出現(xiàn)腫瘤病灶對放療的敏感性逐漸降低,也就是所謂的“放療抵抗”,它是肝癌患者放療后期造成腫瘤治療療效不理想的主要因素之一,因此針對肝癌放療過程中出現(xiàn)的放療抵抗進行更為深入的潛在性研究,并能從中尋找出解決這一難題的方法則顯得尤為重要。在此項研究中,我們試圖探討:1.放療射線是否可促進早期生長因子(Egr-1)及自噬相關蛋白的表達。2.肝癌細胞能否通過自噬引起放療抵抗的相關分子機制。3.Egr-1是否通過與自噬相關基因4B(Atg4B)結合從而調控自噬過程�？偟膩碚f,就是探明Egr-1在放療時電離輻射促進肝癌細胞自噬過程,從而引起放療抵抗這一過程的分子機制。此項研究成果能為能日后應用于臨床并最終克服放療抵抗這一難關提供相關科學理論基礎。方法:1.Western blotting方法檢測不同電離輻射條件下對肝癌細胞中早期轉錄因子Egr-1及自噬相關基因Atg-4b、p62及LC3蛋白表達情況的影響。2.用腺病毒DN-Egr-1競爭性抑制Egr-1后,應用CCK8法、克隆形成試驗、Transwell試驗檢測經高能X射線照射后肝癌細胞存活能力、克隆形成能力及遷移能力的改變。3.用腺病毒DN-Egr-1競爭性抑制Egr-1后,Western blotting方法檢測凋亡相關蛋白表達情況。4.Luciferase試驗和CHIP(染色質免疫共沉淀)試驗驗證肝癌細胞中Egr-1與Atg-4b的結合并對Atg-4b表達的起到調控作用。5.應用自噬抑制劑3MA和氯喹抑制自噬,Western blotting及克隆形成試驗檢測過表達Egr-1的肝癌細胞凋亡相關蛋白的表達情況及細胞克隆形成能力。結果:1.以0、2、4、8Gy劑量分別照射HepG2和SMMC-7721細胞株,并檢測Egr-1表達量,蛋白印跡技術結果顯示Egr-1在8Gy照射量時表達量顯著增高。2.用腺病毒空載體(Ad-GFP)和Ad-DN-Egr-1病毒分別感染SMMC-7721和HepG2細胞。相比于空白對照組,感染了Ad-DN-Egr-1的肝癌細胞經過8Gy的照射后細胞存活率顯著降低。將SMMC-7721細胞暴露在8Gy強度的電離輻射下,72小時測得對照組細胞存活率74.9%,感染了Ad-DN-Egr-1試驗組細胞存活率49.4%。同樣的在HepG2細胞中存活率分別為61.3%和38.2%。3.克隆形成試驗結果顯示經8Gy劑量照射的感染了Ad-DN-Egr-1的肝癌細胞克隆形成能力相較于對照組明顯下降,與此相反,transwell試驗結果顯示感染了Ad-DN-Egr-1的肝癌細胞遷移能力顯著增強。4.8Gy照射劑量條件下,同時抑制Egr-1表達,SMMC-7721和HepG2細胞的蛋白免疫印記結果均顯示抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量減少,而凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達增加。5.Western blotting檢測經放療照射的肝癌細胞自噬相關蛋白水平變化。相比于未予射線處理組,射線處理組自噬標志性蛋白Atg4B,LC3II蛋白表達量增加,而自噬底層蛋白p62/SQSTM1表達量減少,尤其是在8Gy照射劑量時較為明顯。6.使用自噬抑制劑3-MA和CQ封閉掉實驗組細胞自噬過程,克隆形成試驗結果可見,實驗組HepG2和SMMC-7721細胞株,在相同的射線照射條件下,其增殖能力較未被抑制自噬的對照組細胞顯著降低。同樣的,Western blotting檢測到使用自噬抑制劑CQ和3-MA組的實驗組肝癌細胞Bcl-2表達量顯著降低,而Bax和cleaved caspase-3表達量增加。7.Luciferase試驗結果表明,經照射組熒光素酶活性顯著增強,而用DN-Egr-1抑制Egr-1表達后熒光素酶活性顯著降低;CHIP實驗結果示,預測的Atg4B啟動子區(qū)域的三個潛在結合位點均可與Egr-1結合,經照射,Egr-1的抗體可分別沉淀下Atg4B的三個啟動子序列靶點。8.自噬抑制劑處理HepG2和SMMC-7721細胞,后過表達Egr-1,western結果顯示肝癌細胞凋亡蛋白表達減少,克隆形成試驗提示實驗組肝癌細胞克隆形成能力較對照組提高。結論:(1)高能X射線照射可誘導肝癌細胞即刻產生大量Egr-1調控細胞自噬,從而導致放療抵抗,而抑制Egr-1可部分逆轉這一過程;(2)轉錄因子Egr-1可通過與自噬相關蛋白Atg4B的結合,調控肝癌細胞自噬過程的發(fā)生。
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【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：2431449