【摘要】：目的:放療是肝癌治療過程中的重要環(huán)節(jié)之一,它能對癌細(xì)胞起到有力的殺傷作用,但是隨著放療次數(shù)的增多,可能會(huì)出現(xiàn)腫瘤病灶對放療的敏感性逐漸降低,也就是所謂的“放療抵抗”,它是肝癌患者放療后期造成腫瘤治療療效不理想的主要因素之一,因此針對肝癌放療過程中出現(xiàn)的放療抵抗進(jìn)行更為深入的潛在性研究,并能從中尋找出解決這一難題的方法則顯得尤為重要。在此項(xiàng)研究中,我們試圖探討:1.放療射線是否可促進(jìn)早期生長因子(Egr-1)及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。2.肝癌細(xì)胞能否通過自噬引起放療抵抗的相關(guān)分子機(jī)制。3.Egr-1是否通過與自噬相關(guān)基因4B(Atg4B)結(jié)合從而調(diào)控自噬過程�？偟膩碚f,就是探明Egr-1在放療時(shí)電離輻射促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬過程,從而引起放療抵抗這一過程的分子機(jī)制。此項(xiàng)研究成果能為能日后應(yīng)用于臨床并最終克服放療抵抗這一難關(guān)提供相關(guān)科學(xué)理論基礎(chǔ)。方法:1.Western blotting方法檢測不同電離輻射條件下對肝癌細(xì)胞中早期轉(zhuǎn)錄因子Egr-1及自噬相關(guān)基因Atg-4b、p62及LC3蛋白表達(dá)情況的影響。2.用腺病毒DN-Egr-1競爭性抑制Egr-1后,應(yīng)用CCK8法、克隆形成試驗(yàn)、Transwell試驗(yàn)檢測經(jīng)高能X射線照射后肝癌細(xì)胞存活能力、克隆形成能力及遷移能力的改變。3.用腺病毒DN-Egr-1競爭性抑制Egr-1后,Western blotting方法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。4.Luciferase試驗(yàn)和CHIP(染色質(zhì)免疫共沉淀)試驗(yàn)驗(yàn)證肝癌細(xì)胞中Egr-1與Atg-4b的結(jié)合并對Atg-4b表達(dá)的起到調(diào)控作用。5.應(yīng)用自噬抑制劑3MA和氯喹抑制自噬,Western blotting及克隆形成試驗(yàn)檢測過表達(dá)Egr-1的肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況及細(xì)胞克隆形成能力。結(jié)果:1.以0、2、4、8Gy劑量分別照射HepG2和SMMC-7721細(xì)胞株,并檢測Egr-1表達(dá)量,蛋白印跡技術(shù)結(jié)果顯示Egr-1在8Gy照射量時(shí)表達(dá)量顯著增高。2.用腺病毒空載體(Ad-GFP)和Ad-DN-Egr-1病毒分別感染SMMC-7721和HepG2細(xì)胞。相比于空白對照組,感染了Ad-DN-Egr-1的肝癌細(xì)胞經(jīng)過8Gy的照射后細(xì)胞存活率顯著降低。將SMMC-7721細(xì)胞暴露在8Gy強(qiáng)度的電離輻射下,72小時(shí)測得對照組細(xì)胞存活率74.9%,感染了Ad-DN-Egr-1試驗(yàn)組細(xì)胞存活率49.4%。同樣的在HepG2細(xì)胞中存活率分別為61.3%和38.2%。3.克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)8Gy劑量照射的感染了Ad-DN-Egr-1的肝癌細(xì)胞克隆形成能力相較于對照組明顯下降,與此相反,transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示感染了Ad-DN-Egr-1的肝癌細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)。4.8Gy照射劑量條件下,同時(shí)抑制Egr-1表達(dá),SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的蛋白免疫印記結(jié)果均顯示抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量減少,而凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)增加。5.Western blotting檢測經(jīng)放療照射的肝癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白水平變化。相比于未予射線處理組,射線處理組自噬標(biāo)志性蛋白Atg4B,LC3II蛋白表達(dá)量增加,而自噬底層蛋白p62/SQSTM1表達(dá)量減少,尤其是在8Gy照射劑量時(shí)較為明顯。6.使用自噬抑制劑3-MA和CQ封閉掉實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自噬過程,克隆形成試驗(yàn)結(jié)果可見,實(shí)驗(yàn)組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞株,在相同的射線照射條件下,其增殖能力較未被抑制自噬的對照組細(xì)胞顯著降低。同樣的,Western blotting檢測到使用自噬抑制劑CQ和3-MA組的實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)量顯著降低,而Bax和cleaved caspase-3表達(dá)量增加。7.Luciferase試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)照射組熒光素酶活性顯著增強(qiáng),而用DN-Egr-1抑制Egr-1表達(dá)后熒光素酶活性顯著降低;CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,預(yù)測的Atg4B啟動(dòng)子區(qū)域的三個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)均可與Egr-1結(jié)合,經(jīng)照射,Egr-1的抗體可分別沉淀下Atg4B的三個(gè)啟動(dòng)子序列靶點(diǎn)。8.自噬抑制劑處理HepG2和SMMC-7721細(xì)胞,后過表達(dá)Egr-1,western結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)減少,克隆形成試驗(yàn)提示實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞克隆形成能力較對照組提高。結(jié)論:(1)高能X射線照射可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞即刻產(chǎn)生大量Egr-1調(diào)控細(xì)胞自噬,從而導(dǎo)致放療抵抗,而抑制Egr-1可部分逆轉(zhuǎn)這一過程;(2)轉(zhuǎn)錄因子Egr-1可通過與自噬相關(guān)蛋白Atg4B的結(jié)合,調(diào)控肝癌細(xì)胞自噬過程的發(fā)生。
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【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2431449