【摘要】：結(jié)直腸癌(colorectal cancers;CRC)是全球發(fā)病率居第三位的惡性腫瘤,它的發(fā)病與遺傳因素和環(huán)境因素相關(guān),其發(fā)病分子機(jī)制主要有:遺傳不穩(wěn)定性增加、甲基化表型以及KRAS、BRAF等基因的突變。近年來(lái)我國(guó)CRC的發(fā)病率呈上升的趨勢(shì),大部分患者在確診時(shí)就已有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,并且以結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移最為常見。雖然手術(shù)切除肝轉(zhuǎn)移瘤可以使20-30%的患者獲得治愈,但由于肝轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目、大小、解剖位置等原因,僅有少部分的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者能夠獲得手術(shù)切除的機(jī)會(huì),絕大部分患者是沒有手術(shù)機(jī)會(huì)的。因此轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer;mCRC)的藥物治療尤為重要。伊立替康(irinotecan)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及氟尿嘧啶(fluorouracil)等針對(duì)CRC的化療藥物雖然能提高mCRC的療效,但患者的中位生存期仍不到2年。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái),單克隆抗體已經(jīng)在臨床上用于治療包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的許多疾病。并且,靶向EGFR的單克隆抗體西妥昔單抗(cetuximab)成為mCRC治療的一個(gè)突破。西妥昔單抗與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor;EGFR)均有非常高的親和力,可競(jìng)爭(zhēng)性阻斷EGFR與其配體-表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor;EGF)等的結(jié)合,從而阻斷EGFR下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而,西妥昔單抗的價(jià)格都非常昂貴,而且,西妥昔單抗單藥治療mCRC的有效率并不理想�；谶@兩方面,提高或改善靶向EGFR單克隆抗體的療效成為迫切需要解決的問(wèn)題。而導(dǎo)致靶向EGFR單克隆抗體治療mCRC有效率不高的主要原因是存在極其嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題,所以,探索靶向EGFR單克隆抗體的耐藥機(jī)制并找到解決方案成為提高其療效的重中之重。目前,對(duì)于靶向EGFR單克隆抗體的原發(fā)耐藥機(jī)制的研究主要集中在EGFR信號(hào)通路的基因上,通過(guò)篩查腫瘤標(biāo)本中KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA和PTEN等預(yù)測(cè)因子的突變情況來(lái)篩選出原發(fā)耐藥的患者。然而,對(duì)已經(jīng)進(jìn)行了原發(fā)腫瘤根治性切除的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者而言,受轉(zhuǎn)移灶的大小和位置等原因限制,獲取轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織在臨床常常是較為困難的,而且對(duì)患者本身可能會(huì)造成一定的傷害,存在著較大的風(fēng)險(xiǎn)。此外,腫瘤組織還存在著一定的腫瘤異質(zhì)性。因此進(jìn)一步研究探索新的耐藥機(jī)制非常必要。本研究的主要目的即為研究探索導(dǎo)致靶向EGFR單抗耐藥的新的分子機(jī)制,找到克服耐藥的方法,提高單克隆抗體的療效,為患者的個(gè)體化治療提供理論基礎(chǔ)。首先,通過(guò)對(duì)798株細(xì)胞系基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)胞株對(duì)西妥昔單抗的敏感性和耐藥性,我們發(fā)現(xiàn)PRSS1在西妥昔單抗耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)水平明顯高于西妥昔單抗敏感細(xì)胞株。PRSS1基因編碼一種絲氨酸蛋白酶,也被稱為胰蛋白酶原,是一種主要由胰腺分泌的用于激活各種蛋白酶的消化酶。在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中,PRSS1可能參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。接著,我們檢測(cè)了八株結(jié)腸癌細(xì)胞系中PRSS1的表達(dá)水平,同樣發(fā)現(xiàn)PRSS1在對(duì)西妥昔單抗耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于敏感的結(jié)腸癌細(xì)胞系。另外,通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)49例使用西妥昔單抗治療的結(jié)腸癌患者腫瘤組織中PRSS1的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn):在19例對(duì)西妥昔單抗原發(fā)耐藥的患者的腫瘤標(biāo)本中,16例患者的腫瘤標(biāo)本均表達(dá)PRSS1,僅3例患者腫瘤標(biāo)本不表達(dá)PRSS1;而在30例對(duì)西妥昔單抗治療有效的患者的腫瘤標(biāo)本中,僅5例患者的腫瘤標(biāo)本中檢測(cè)到PRSS1的表達(dá),其余25例患者的腫瘤標(biāo)本均為PRSS1表達(dá)陰性;即對(duì)西妥昔單抗治療原發(fā)耐藥的患者,其腫瘤標(biāo)本中PRSS1的表達(dá)水平明顯的高于對(duì)西妥昔單抗治療有效患者的腫瘤標(biāo)本。這些結(jié)果充分顯示PRSS1的表達(dá)水平與西妥昔單抗的療效相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PRSS1可以導(dǎo)致西妥昔單抗的耐藥,我們對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行了PRSS1的敲低和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。首先,采用針對(duì)PRSS1的shRNA敲低了HT-29和LoVo細(xì)胞中PRSS1的表達(dá),發(fā)現(xiàn):成功敲低這兩株結(jié)腸癌細(xì)胞中PRSS1的表達(dá)水平后,細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的耐藥性顯著減弱;反之,我們對(duì)PRSS1表達(dá)水平低的DiFi和LoVo細(xì)胞進(jìn)行了PRSS1的過(guò)表達(dá),發(fā)現(xiàn):成功過(guò)表達(dá)PRSS1之后,這兩株結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的耐藥性明顯增強(qiáng);即干預(yù)細(xì)胞中PRSS1的表達(dá)水平可以影響細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的耐藥性。為了探索PRSS1導(dǎo)致西妥昔單抗耐藥的具體分子機(jī)制,我們用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRSS1對(duì)單克隆抗體的降解。發(fā)現(xiàn)PRSS1通過(guò)降解西妥昔單抗,使其對(duì)EGFR信號(hào)通路的抑制明顯減弱,進(jìn)而導(dǎo)致耐藥。對(duì)PRSS1降解西妥昔單抗的降解片段進(jìn)行N端測(cè)序,發(fā)現(xiàn)PRSS1可以識(shí)別和降解包括西妥昔單抗、貝伐珠單抗和曲妥珠單抗在內(nèi)的單克隆抗體類藥物,使單克隆抗體類藥物的功能和療效減弱,進(jìn)而導(dǎo)致耐藥。另外,PRSS1降解單克隆抗體存在著序列特異性,針對(duì)這種序列特異性,對(duì)預(yù)測(cè)的PRSS1識(shí)別單克隆抗體的位點(diǎn)進(jìn)行突變,可以改變單克隆抗體被PRSS1降解的程度,進(jìn)而提高單克隆抗體的療效。接著,我們進(jìn)行了裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)PRSS1的抑制劑SPINK1可以很好的抑制PRSS1對(duì)單克隆抗體的降解,從而提高單克隆抗體的療效。即單克隆抗體與PRSS1的抑制劑SPINK1的聯(lián)合用藥,可以顯著地提高單克隆抗體的療效,更好地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖。進(jìn)一步在臨床水平進(jìn)行驗(yàn)證,我們檢測(cè)了54例使用西妥昔單抗進(jìn)行治療的患者血清中PRSS1的水平。發(fā)現(xiàn):血清中PRSS1的水平較高的腫瘤患者對(duì)單克隆抗體的療效普遍較差。患者血清中PRSS1的水平越高,患者的無(wú)疾病進(jìn)展期就越短,即PRSS1的高表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤患者對(duì)西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥性。連續(xù)檢測(cè)患者在西妥昔單抗治療過(guò)程中血清PRSS1的水平,發(fā)現(xiàn)PRSS1可以做為單克隆抗體的一個(gè)療效預(yù)測(cè)分子�？偠灾�,PRSS1在導(dǎo)致單克隆抗體的耐藥中發(fā)揮著重要的作用,并且,PRSS1可作為一種輔助臨床用藥的療效預(yù)測(cè)分子,即臨床上通過(guò)監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)PRSS1的表達(dá)水平,可預(yù)測(cè)患者對(duì)單克隆抗體的療效,并及時(shí)更換有效的治療方案,以提高患者的療效、改善患者的生活質(zhì)量。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2415380