【摘要】：由于生物酶對反應(yīng)環(huán)境的要求苛刻,還具有相對活性較低以及不可重復(fù)利用等缺陷,使得人工模擬酶成為研究熱點�；诿冈谏锖凸I(yè)中具有重要性,構(gòu)筑高活性的模擬酶極具挑戰(zhàn)性。癌癥的發(fā)病率和致死率不斷增高,尤其卵巢癌,是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第二的致死率最高的婦科惡性腫瘤。目前,提高患者存活率的關(guān)鍵在于癌癥的早期診斷以及使用新型的活性更高的抗癌試劑進行治療。越來越多的證據(jù)表明細胞微環(huán)境在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色,腫瘤微環(huán)境包含許多影響血管生成的信號分子。腫瘤的生長增殖依賴于血管生成為其提供氧氣和營養(yǎng)。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMP),一種鋅結(jié)合蛋白包括膠原酶MMP-2和MMP-9,能水解細胞外基質(zhì)而在血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。靶向腫瘤微環(huán)境和腫瘤細胞是腫瘤協(xié)同治療的新策略。金屬有機骨架材料(metal-organic frameworks,簡稱MOFs)是一類獨特的基于金屬離子或金屬簇和有機配體的固態(tài)多孔材料。與傳統(tǒng)多孔材料相比,他們具有高比表面、高孔隙度、可調(diào)孔徑以及拓撲結(jié)構(gòu),使它們在很多領(lǐng)域的應(yīng)用具有獨特的優(yōu)勢。隨著MOFs種類和結(jié)構(gòu)的增多,其應(yīng)用范圍也在不斷擴展。但到目前為止,關(guān)于MOFs細胞毒性的相關(guān)信息還很少,當下MOFs在癌癥治療中僅用作顯影造影劑以及藥物傳輸載體。沒有直接將MOFs用于殺癌細胞的報道。同時也未見將MOFs用于模擬蛋白酶的報道。基于此,本論文對Cu-MOF和Fe-MIL-101材料的模擬酶活性及對癌細胞的作用(細胞消化分離、細胞檢測、細胞毒性、細胞遷移、抗血管生成、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2/9)以及肌動蛋白(actin)表達)進行研究。首次報道Cu-MOF具有模擬蛋白酶的活性并將其應(yīng)用于消化分離細胞。同時發(fā)現(xiàn)Fe-MIL-101具有內(nèi)在模擬過氧化物酶的活性并且在中性條件下具有較高的活性。我們未經(jīng)表面修飾將葉酸與Fe-MIL-101結(jié)合設(shè)計和開發(fā)了一種基于Fe-MIL-101的模擬過氧化物酶活性的一種簡單、便宜、高選擇性高靈敏度比色檢測癌細胞的方法。此外,論文還探討了兩種MOFs抑制癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機理。論文的主要內(nèi)容包括：(1)將Cu-MOF用于模擬蛋白酶催化水解蛋白質(zhì),探索了反應(yīng)溫度、pH、反應(yīng)時間等影響因素對催化反應(yīng)的影響,并研究了催化動力學和反應(yīng)機理。研究發(fā)現(xiàn)Cu-MOF具有類似于胰酶的內(nèi)在模擬酶性質(zhì),米氏常數(shù)比胰蛋白酶的小26,000倍,說明Cu-MOF對BSA的親和力高于胰酶。同時Cu-MOF對牛血清白蛋白的親和力高于報道的大部分以Cu為催化活性中心的人工蛋白酶,且催化性能比均相催化劑Cu(Ⅱ)復(fù)合物顯著提高。該催化劑具有較強的水熱穩(wěn)定性,循環(huán)使用十次后,催化效果基本不變。并首次將Cu-MOF用于消化分離細胞,不含EDTA的Cu-MOF能成功模擬胰酶消化細胞。本研究為MOFs的應(yīng)用開辟了新的途徑。(2)將Fe-MIL-101用于模擬過氧化物酶催化氧化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯二胺(TMB),探索了催化劑用量、反應(yīng)溫度、pH、H2O2用量等影響因素對催化反應(yīng)的影響,并研究了催化動力學和反應(yīng)機理。研究發(fā)現(xiàn)Fe-MIL-101在廣泛pH范圍具有類似天然辣根過氧化物酶的內(nèi)在模擬過氧化物酶活性,甚至在中性條件下表現(xiàn)出較高的催化活性。以H2O2為底物時,Fe-MIL-101的米氏常數(shù)比天然辣根過氧化物酶低約616倍(pH 4.0)和20倍(pH 7.0),顯示出比HRP更強的對H2O2的親和力。另外,Fe-MIL-101不經(jīng)任何表面修飾通過結(jié)合葉酸來檢測癌細胞,對HeLa的檢測限達到50個,且在細胞數(shù)為10個時,肉眼可分辨反應(yīng)顏色。提供了一種簡單、靈敏、通用的特異性檢測癌細胞的方法。(3)對Fe-MIL-101抗癌活性評價,通過MTT法分析Fe-MIL-101對人宮頸癌HeLa,人非小細胞肺癌A549,人卵巢癌SKOV3、人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC和正常小鼠胚胎成纖細胞BABL-3T3的細胞毒性,發(fā)現(xiàn)Fe-MIL-101對卵巢癌SKOV3(IC50=23.6μg mL-1)細胞以及血管內(nèi)皮HUVEC(IC50=9.9μg mL-1)細胞具有選擇性抑制作用,但對正常的小鼠胚胎成纖細胞BABL-3T3(IC50=77.8 μgmL-1)的毒性較弱。通過AO/EB. Hoechst 33342和JC-1染色以及流式分析表明Fe-MIL-101通過阻滯細胞于G0/G1期和降低細胞線粒體膜電位誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡。蛋白免疫印跡法結(jié)果表明Fe-MIL-101通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達抑制SKOV3細胞遷移和血管生成。(4)對Cu-MOF抗癌活性評價,通過MTT法分析Cu-MOF對人非小細胞肺癌A549、人卵巢癌SKOV3、人口腔上皮癌細胞KB、人結(jié)腸直癌細胞HT-29和正常細胞：BABL-3T3的細胞毒性,發(fā)現(xiàn)Cu-MOF具有有效區(qū)別癌細胞和正常細胞的能力。通過AO/EB、Hoechst 33342和JC-1染色以及流式分析表明Cu-MOF凋亡通過阻滯細胞于G2/M期和降低細胞線粒體膜電位誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示Cu-MOF通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9、active-MMP-2和肌動蛋白actin的表達抑制SKOV3細胞遷移。
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【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
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本文編號：2412469