【摘要】：肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的高死亡率的原發(fā)性肝癌,它是全球范圍內(nèi)最常見的一種惡性腫瘤。世界范圍內(nèi)每年有超過70萬肝癌新發(fā)病例,約60萬人死于肝癌,其中有超過50%的肝癌發(fā)生在中國。盡管已經(jīng)實(shí)施對高危人群進(jìn)行篩查,但絕大多數(shù)患者仍無法治愈,并且對于晚期患者,其中位生存期不足12個月。由于肝細(xì)胞肝癌缺乏典型的臨床癥狀,早期診斷和治療十分困難,同時肝細(xì)胞肝癌具有高侵襲性,而轉(zhuǎn)移性肝癌幾乎耐受所有常規(guī)的化療藥物,這都嚴(yán)重影響病人生存期。肺部是肝細(xì)胞肝癌最常見的肝外轉(zhuǎn)移部位,然而其原因和機(jī)制尚不清楚。尋找肝細(xì)胞肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)志物以及研究其轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制將有助于提高肝細(xì)胞肝癌的治療效果。Micro RNA是一類長度為18~25個核苷酸的單鏈非編碼RNA分子,現(xiàn)在已有超過2500個micro RNA在植物、動物和病毒中被鑒定出。micro RNA在細(xì)胞核內(nèi)生成后,經(jīng)由核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)送到胞漿,然后被引導(dǎo)進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中,通過與靶基因m RNA堿基互補(bǔ)配對引起靶基因m RNA降解或翻譯的抑制。近幾十年的研究表明micro RNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及遷移過程中起到重要作用。近來,關(guān)于mi R-195在腫瘤發(fā)生及癌癥治療方面作用的研究越來越多。一些研究證實(shí)過表達(dá)mi R-195能夠通過打靶myb顯著抑制肺癌增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。在腸癌中,mi R-195通過打靶CARMA3抑制細(xì)胞增殖、克隆形成和侵襲。最近研究發(fā)現(xiàn)了一些與HCC相關(guān)的mi R-195的靶基因,包括Wnt3a,Pcmt1,VAV2,CDC42和VEGF。血管生成是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展形成新的血管,是多種惡性腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的必要的復(fù)雜過程。FGF2和VEGFA,作為最重要的血管生成因子,已成為腫瘤等存在血管生成異常的疾病的治療靶標(biāo)。FGF2在調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移方面起重要作用,在黑色素瘤、鼻咽癌、前列腺癌等異常表達(dá)。VEGF能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,增加血管通透性,促進(jìn)細(xì)胞遷移,在乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、大腸癌中高表達(dá)。有研究表明FGF2和VEGFA在HCC組織中顯著升高,但其機(jī)制尚不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中,我們分析肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的mi RNA芯片,發(fā)現(xiàn)mi R-195是與肺轉(zhuǎn)移的HCC密切相關(guān)的mi RNA。通過Real-time PCR技術(shù),我們檢測了92例HCC組織中mi R-195的表達(dá)。通過micro RNA靶基因預(yù)測軟件對mi R-195下游靶基因進(jìn)行分析,并通過與血管相關(guān)基因進(jìn)行交叉分析,鑒定出血管生成相關(guān)mi R-195靶基因。然后我們利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)對這一推測進(jìn)行驗(yàn)證。此外我們采用慢病毒感染技術(shù)構(gòu)建mi R-195穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,利用Transwell技術(shù)檢測mi R-195對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。綜上所述,我們的發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充了對HCC轉(zhuǎn)移的了解,為HCC的治療提供了新的方向。第一部分肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)mi RNAs的篩選以及mi R-195在肝癌中的表達(dá)與臨床意義方法1、生物信息學(xué)分析肺轉(zhuǎn)移肝癌的相關(guān)mi RNA。2、Real-time PCR方法檢測mi R-195在肝癌組織中的表達(dá)水平。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析mi R-195的表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果1、通過肝癌組織芯片分析鑒定出肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移過程中20個降低的micro RNAs和4個升高的micro RNAs。2、Real-time PCR結(jié)果顯示mi R-195在肝癌組織中的表達(dá)量顯著低表達(dá)。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)mi R-195低表達(dá)與腫瘤大小、門靜脈血栓形成、TNM分期以及病人存活率有關(guān)。方法1、生物信息學(xué)預(yù)測與血管發(fā)生相關(guān)的mi R-195的靶基因。2、生物信息學(xué)分析mi R-195與FGF2和VEGFA的3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)。3、構(gòu)建3’UTR質(zhì)粒,并通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證FGF2和VEGFA是mi R-195的靶基因。4、利用慢病毒感染技術(shù)構(gòu)建mi R-195穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。5、ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mi R-195對FGF2和VEGFA的調(diào)節(jié)作用。6、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測mi R-195對BEL-7402細(xì)胞系轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。結(jié)果1、生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)血管生成因子FGF2和VEGFA為mi R-195的靶基因。2、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)FGF2和VEGFA是mi R-195的靶基因。3、成功構(gòu)建mi R-195穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞系。4、ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)mi R-195抑制FGF2和VEGFA的表達(dá)。5、Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)mi R-195抑制BEL-7402細(xì)胞系遷移和侵襲能力。結(jié)論1、mi R-195在肝癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞系及肝癌組織中的表達(dá)明顯降低。2、HCC組織中mi R-195的表達(dá)水平與腫瘤大小、門靜脈血栓、TNM分期及總體生存期相關(guān),預(yù)示著mi R-195可以作為判斷HCC患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。3、mi R195能夠通過抑制FGF2和VEGFA的表達(dá)抑制BEL-7402細(xì)胞系遷移侵襲能力。第二部分mi R-195抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制的初步探索
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2410974