【摘要】：肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，且近年來其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，由于一直缺少有效的藥物和治療手段，臨床中很難取得滿意的治療效果。因此，肝癌特效藥物的研究將可極大提高肝癌患者的生存期和生存質(zhì)量，這也是國家多次五年計(jì)劃中治療重大疾病新藥創(chuàng)制的重點(diǎn)方向。 靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（Ling Zhi-8，LZ-8）是一種從赤靈芝（Ganodermalucidium）菌絲體中提取出的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。在抗腫瘤研究中，我們發(fā)現(xiàn)rLZ-8具有大量進(jìn)入并殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，同時(shí)對正常組織細(xì)胞卻無殺傷作用。論文作者所在課題組已有大量研究表明進(jìn)入腫瘤細(xì)胞是rLZ-8執(zhí)行抗腫瘤作用的先決條件，因此，，明確rLZ-8的入胞機(jī)制在rLZ-8的抗腫瘤研究中至關(guān)重要。 本論文根據(jù)天然LZ-8的氨基酸序列及畢赤酵母的密碼子偏好性，將LZ-8基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，合成目的基因并構(gòu)建pGAPZα A-rLZ-8重組質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)化法將目的基因整合到組成型表達(dá)載體X-33酵母基因組中。經(jīng)Zeocin抗性培養(yǎng)基和PCR、Western Blot鑒定篩選出成功整合并表達(dá)rLZ-8的酵母工程菌，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化獲得了高純度的rLZ-8，經(jīng)蛋白質(zhì)N端測序證明與天然LZ-8一致。 在后續(xù)研究中，我們通過觀察熒光標(biāo)記的rLZ-8在肝癌細(xì)胞HepG2中的定位來進(jìn)行rLZ-8內(nèi)吞機(jī)制的初步研究。通過選用針對不同細(xì)胞內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑，研究和分析了rLZ-8入胞依賴的內(nèi)吞途徑，并通過siRNA干擾第一輪篩選到的通路中關(guān)鍵基因進(jìn)行了表達(dá)抑制，對細(xì)胞內(nèi)吞的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步確證。主要研究結(jié)果如下： 1、rLZ-8進(jìn)入HepG2細(xì)胞不依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑 網(wǎng)格蛋白抑制劑氯丙嗪可阻斷網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，但并不影響rLZ-8進(jìn)入HepG2細(xì)胞，提示rLZ-8進(jìn)入細(xì)胞不通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。 2、rLZ-8進(jìn)入HepG2細(xì)胞不依賴小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑 小窩/脂筏依賴內(nèi)吞途徑抑制劑，即膽固醇抽提劑制菌霉素和孕酮，二者可以去除細(xì)胞膜上膽固醇及破壞小窩結(jié)構(gòu)的完整性來抑制小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述兩種抑制劑對rLZ-8的入胞過程均無影響，提示rLZ-8的入胞機(jī)制與小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑無關(guān)。 3、rLZ-8進(jìn)入HepG2細(xì)胞與Src激酶有關(guān) 研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Src激酶特異性抑制劑Genistein處理后，HepG2細(xì)胞對rLZ-8的內(nèi)吞作用受到明顯抑制，提示rLZ-8入胞機(jī)制與Src激酶有關(guān)。為了進(jìn)一步確證，我們使用siRNA特異性抑制了c-Src蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明rLZ-8的內(nèi)吞作用受到了顯著抑制，證明了rLZ-8的入胞跟Src激酶有關(guān)。 4、rLZ-8進(jìn)入HepG2細(xì)胞與Src-PI3K信號(hào)通路有關(guān)系 研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PI3K特異性抑制劑Wortmannin處理后，HepG2細(xì)胞對rLZ-8的內(nèi)吞作用部分受到抑制，且c-Src是PI3K的上游分子，提示rLZ-8入胞機(jī)制可能與Src-PI3K通路有關(guān)系。 綜上所述，本文利用組成型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了rLZ-8，并得到了高純度和具有穩(wěn)定生物活性的rLZ-8。在rLZ-8內(nèi)吞機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)rLZ-8進(jìn)入HepG2細(xì)胞與經(jīng)典的網(wǎng)格蛋白和小窩/脂筏依賴內(nèi)吞途徑無關(guān)，與Src激酶和Src-PI3K通路有關(guān)，具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。 對rLZ-8進(jìn)入HepG2細(xì)胞中所涉及的途徑和調(diào)控機(jī)制的進(jìn)行初步篩選，有利于深入研究和闡明rLZ-8的抗腫瘤機(jī)理，并為其作為抗肝癌新藥的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2408355