【摘要】：研究背景乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,具有高發(fā)病率和高死亡率,且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,嚴(yán)重地威脅著女性的健康。隨著人們的生活方式的改變,2型糖尿病在全球范圍內(nèi)發(fā)病率也呈現(xiàn)上升的趨勢。2型糖尿病患者與乳腺癌患者有著相似的生活方式及免疫分子因素等,如高體重指數(shù),腹型肥胖,體力活動少,攝取高熱量食物及高胰島素血癥和胰島素抵抗等。越來越多的流行病學(xué)研究表明2型糖尿病與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān),2型糖尿病可顯著升高乳腺癌的發(fā)病率,同時是乳腺癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的一個獨立的預(yù)后危險因子,合并有2型糖尿病的乳腺癌患者分期晚,預(yù)后差。高糖環(huán)境下,高代謝的腫瘤細胞可通過提高糖的利用率來促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲。而腫瘤細胞的低氧、低營養(yǎng)、低pH的微環(huán)境可激活腫瘤細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),利用未折疊蛋白反應(yīng)促進自身的發(fā)生發(fā)展。我們推測在高血糖的環(huán)境下,腫瘤細胞可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來促進腫瘤細胞的旺盛增殖。而預(yù)實驗結(jié)果表明,間斷高糖而不是持續(xù)高糖更能促進人乳腺癌MCF-7細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本文將探討間斷高糖對人乳腺癌MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲的影響,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)/PTP1B/STAT3信號通路在其中的作用。方法1.初步探討間斷高糖狀態(tài)下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否被激活,以及間斷高糖對MCF-7細胞的增殖、調(diào)亡、遷移和侵襲能力的影響。分別采用糖濃度5.5mmol/L、11mmol/L、 22mmol/L與5.5mmol/L的培養(yǎng)液交替培養(yǎng),12小時后換液1次,處理MCF-7細胞2天、4天、6天,采用Western-blott方法檢測人乳腺癌MCF-7細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物CHOP和GRP78蛋白的表達來確定最佳作用的糖的濃度和時間。當(dāng)采用最佳作用的濃度和時間即22mmol/L處理MCF-7細胞6天后,采用MTT法,TUNEL法,劃痕試驗和侵襲試驗檢測細胞增殖、調(diào)亡、遷移和侵襲能力的變化；加用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑(4-PBA)對MCF-7細胞進行處理,采用MTT法,TUNEL法,劃痕試驗和侵襲試驗檢測細胞增殖、調(diào)亡、遷移和侵襲能力的變化。2.我們進一步探討間斷高糖狀態(tài)下的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否由PTP1B所介導(dǎo)。首先采用間斷高糖作用于MCF-7細胞,同時給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑4-PBA對MCF-7細胞進行處理后,采用RT-PCR和Western-blott方法來檢測CHOP、GRP78、PTP1B、 STAT3的基因和蛋白表達的變化,同時采用蛋白酶分析檢測PTP1B酶活性。然后用間斷高糖處理MCF-7細胞后,加用PTP1B抑制劑(CinnGEL2Me)處理,采用MTT法,TUNEL法,劃痕試驗和侵襲試驗檢測細胞增殖、調(diào)亡、遷移和侵襲能力的變化,同時運用Western blot檢測MCF-7細胞中CHOP、GRP78、PTP1B、STAT3的表達的變化。同樣,采用基因沉默的方法下調(diào)PTPlB的表達,采用MTT法,TUNEL法,劃痕試驗和侵襲試驗檢測細胞增殖、調(diào)亡、遷移和侵襲能力的變化,同時運用Western blot檢測MCF-7細胞中CHOP、GRP78、PTP1B、STAT3的表達的變化。結(jié)果1.從蛋白水平,處理6天時高糖組(22mmol/L)MCF-7細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物GRP78、CHOP蛋白的表達顯著增加,可見高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激呈濃度依賴性和時間依賴性。采用22mmol/L處理MCF-7細胞6天后,采用MTT法,TUNEL法,劃痕試驗和侵襲試驗可發(fā)現(xiàn)間斷高糖可增加細胞的增殖能力,減少細胞凋亡,促進細胞的遷移和侵襲,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑4-PBA可抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所導(dǎo)致的細胞增殖,增加細胞凋亡,抑制細胞的遷移和侵襲。2.采用RT-PCR和Western blot法檢測間斷高糖作用6天后的MCF-7細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物GRP78、CHOP的基因和蛋白的表達均顯著升高,同時PTP1B以及u-STAT3的基因和蛋白的表達也隨之升高,但p-STAT3基因和蛋白的表達降低。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑4-PBA可抑制這一過程。間斷高糖誘導(dǎo)MCF-7細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可增加細胞的增殖能力,減少細胞凋亡,促進細胞的遷移和侵襲,而PTP1B的抑制劑CinnGEL 2Me可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所導(dǎo)致的細胞增殖,增加細胞凋亡,抑制細胞的遷移和侵襲。當(dāng)使用PTP1B抑制劑(CinnGEL 2Me)時u-STAT3、 PTP1B的基因和蛋白的表達下降；使用基因沉默的方式下調(diào)PTP1B表達,u-STAT3、 PTP1B的蛋白的表達亦隨之降低,而p-STAT3的蛋白表達上升,同時,使用基因沉默的方式下調(diào)PTP1B表達可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所導(dǎo)致的細胞增殖,增加細胞凋亡,抑制細胞的遷移和侵襲。結(jié)論1.間斷高糖可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,且呈時間和濃度依賴性。2.間斷高糖可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進人乳腺癌MCF-7細胞的增殖、抑制細胞凋亡,促進細胞的遷移和侵襲的能力,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可顯著抑制間斷高糖的作用。3.間斷高糖增加PTP1B酶活性。4.PTP1B的抑制劑或RNA干擾下調(diào)人乳腺癌細胞MCF-7中PTPIB的表達后,都可顯著抑制間斷高糖所導(dǎo)致的人乳腺癌MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響。5.PTP1B的抑制劑或RNA干擾下調(diào)人乳腺癌細胞MCF-7中PTP1B的表達后,均能顯著抑制人乳腺癌MCF-7細胞內(nèi)PTP1B/STAT3相關(guān)重要因子的表達。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2408387