【摘要】：胃癌是高度危害人類健康的惡性腫瘤,其致死率位居所有腫瘤致死率的第二位。我國是胃癌高發(fā)國家,每年約有17萬人死于胃癌,占消化系統(tǒng)腫瘤死亡人數(shù)的50%以上,臨床治療常以手術(shù)加術(shù)后放化療為主。由于早期臨床癥狀不明顯,致早期診治率較低;又因胃癌腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力強,使得復發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,預后較差。胃癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)。抑癌基因乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(mammary serpin,maspin)在腫瘤細胞增殖、粘附、遷移和凋亡中起關(guān)鍵作用。因此,抑癌基因maspin很有可能成為治療胃癌的潛在靶點。南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)又名過山風、降龍草、黃藤等,始載于清代《植物名實圖考》,其(藤)莖、根、葉、果實、種子均可入藥。屬于衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物,在我國分布較為廣泛,主要用于抗炎鎮(zhèn)痛、活血消腫、祛風解毒等。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),南蛇藤莖提取物(Celastrus Orbiculatus Extracts,COE)具有抑制腫瘤細胞的遷移侵襲與增殖,促進腫瘤細胞凋亡等顯著抗腫瘤的能力。本研究構(gòu)建了消減抑癌基因maspin表達的人胃癌MGC-803細胞,初步探索了 COE通過maspin促進人胃癌細胞凋亡的作用及其分子機制。加入不同濃度的南蛇藤提取物后,與對照組相比,一定濃度范圍內(nèi)(20、40、80μg/mL)的COE可以增加maspin的表達,并呈濃度依賴性,促進了腫瘤細胞凋亡。其分子機制,可能與B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl2)家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(casepase)蛋白以及磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶 B(phosphatidyl-inositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路相關(guān)。本研究共分為三部分。第一部分人胃癌組織樣本中maspiin的表達及人胃癌MGC-803/maspin-細胞株的構(gòu)建目的:觀察人胃癌組織樣本中maspin的表達,構(gòu)建消減maspin表達的人胃癌MGC-803細胞模型。方法:利用免疫組化方法檢測人胃癌組織樣本中maspin的表達水平。體外培養(yǎng)人胃癌細胞MGC-803至對數(shù)期,利用RNAi技術(shù),將maspin siRNA基因整合入MGC-803細胞DNA,使胃癌細胞MGC-803中maspin沉默表達,同時設立野生型細胞組及陰性對照組。轉(zhuǎn)染24 h后,收集人胃癌MGC-803細胞,提取總蛋白和總RNA,分別利用western blot法和qRT-PCR技術(shù),檢測細胞中MASPIN蛋白和RNA的表達情況。結(jié)果:MASPIN蛋白表達于胃間質(zhì)及非腫瘤胃腺組織的胞漿及胞膜中,在胃癌細胞中表達量降低。轉(zhuǎn)染24h后,Western blot結(jié)果顯示,與野生型細胞及陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染maspin siRNA的人胃癌細胞MGC-803細胞中,MASPIN的蛋白表達量顯著減少。qRT-PCR結(jié)果也顯示,與野生型對照組及陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染maspin siRNA的人胃癌細胞MGC-803細胞中maspin的RNA表達水平顯著減少。結(jié)論:胃癌組織樣本中MASPIN表達量降低。成功構(gòu)建人胃癌MGC-803/maspin-細胞。第二部分南蛇藤提取物對人胃癌MGC-803/maspin-細胞增殖和凋亡的影響目的:研究南蛇藤提取物(Celastrusorbiculatus extracts,COE)對人胃癌MGC-803/maspin-細胞凋亡及增殖的影響。方法:對數(shù)期人胃癌MGC-803/maspin-細胞,加入不同濃度的COE(10,20,40,80,160,320 μg/mL)。同時設立陰性對照組、不加藥野生型對照組和陽性對照組(加入32μg/mL的5-Fu)。倒置顯微鏡觀察MGC-803/maspin-細胞形態(tài)變化;透射電鏡觀察藥物對細胞超微結(jié)構(gòu)的影響。MTT法檢測不同濃度COE對人胃癌MGC-803/maspin-細胞增殖的抑制作用;以TUNEL實驗結(jié)合流式細胞術(shù)檢測不同濃度COE對人胃癌MGC-803/maspin-細胞凋亡的改變;JC-1實驗檢測藥物對MGC-803/maspin-線粒體膜電位的改變。Transwell侵襲實驗檢測不同濃度COE作用后,細胞侵襲能力的變化。Transwell遷移實驗和細胞劃痕實驗,檢測不同濃度COE對人胃癌MGC-803/maspin-遷移能力的影響。結(jié)果:抑癌基因maspin沉默表達后,人胃癌MGC-803細胞的凋亡減少,增殖和遷移侵襲能力增強。不同濃度的COE作用后,MASPIN的表達水平增加,呈明顯的濃度依賴性(P0.05或P0.01),1IC50為101.711 g/mL。結(jié)論:抑癌基因maspin在體外對胃癌細胞具有抑制作用;COE增加maspin的表達量且增強其功能,有效促進了人胃癌細胞MGC-803的凋亡,抑制了人胃癌細胞MGC-803的增殖和侵襲遷移能力。第三部分南蛇藤提取物通過抑癌基因maspin促進人胃癌MGC-803細胞凋亡的分子機制目的:研究不同濃度南蛇藤提取物(COE)對人胃癌MGC-803/maspin-細胞的凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、casepase-3)表達水平的影響,初步探討COE促進胃癌細胞凋亡的分子機制。方法:對數(shù)期人胃癌MGC-803/maspin-細胞,為了避免細胞毒性作用的干擾,設置COE低濃度組(20,40,80 μg/mL),同時設立陰性對照組、野生型細胞對照組和陽性對照組(5-Fu 32 μg/mL)。藥物作用24 h后,提取細胞總蛋白,Western blot法檢測PI3K/Akt/mTOR 和 MAPK 信號通路關(guān)鍵蛋白(包括 MASPIN、Bax、Bcl-2、casepase-3、PI3K、Akt、mTOR、Erkl/2、p38MAPK及相應的磷酸化蛋白)的表達水平。結(jié)果:COE 降低 Bcl-2 及 PI3K、Akt,p-Akt、p-mTOR、Erkl/2 蛋白的表達水平,呈濃度依賴性;COE對mTOR、p38MAPK蛋白的表達無明顯影響;隨著COE濃度的增加,Bax、casepase-3、p-Erkl/2、p-p38MAPK蛋白的表達量呈現(xiàn)上升趨勢。結(jié)論:COE促進人胃癌MGC-803/maspin-細胞的凋亡,其機制可能與Bcl-2家族、casepase-3 蛋白及 PI3K/Akt/mTOR、MAPK 信號通路有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：2406869