【摘要】：硒作為一種人體必需的微量元素,在多種生理活動(dòng)中扮演重要角色,臨床研究表明硒還可以用來治療腫瘤。大量的文獻(xiàn)證實(shí)超營養(yǎng)劑量的硒能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及凋亡,對一些惡性腫瘤具有顯著的治療效果,因此硒治療腫瘤的分子機(jī)制也成為研究熱點(diǎn)。結(jié)直腸癌是一種常見的下消化道惡性腫瘤,治愈率較低,而且發(fā)病率在我國呈現(xiàn)逐年增高的趨勢,因此研究亞硒酸鈉治療結(jié)直腸癌的分子機(jī)制具有非常重要的意義。本課題組的前期研究成果表明：超營養(yǎng)劑量的亞硒酸鈉能夠誘導(dǎo)白血病、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡,但是亞硒酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制還有待闡明。本研究旨在探索亞硒酸鈉處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的信號通路,進(jìn)一步揭示亞硒酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。通過前期探索,本研究以結(jié)直腸癌HCT116和SW480細(xì)胞為研究對象,首先發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉對核轉(zhuǎn)錄因子CREB的磷酸化水平具有明顯的抑制作用,而CREB被報(bào)道在腫瘤的生存、遷移等方面扮演重要作用。我們首先通過免疫熒光,染色質(zhì)免疫共沉淀等試驗(yàn)探索亞硒酸鈉處理的細(xì)胞中CREB功能的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉處理造成的CREB磷酸化水平下調(diào)導(dǎo)致了其與靶基因Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合減弱,從而誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)和細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。進(jìn)一步使用CREB-CBP結(jié)合抑制劑與亞硒酸鈉聯(lián)合使用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)亞硒酸鈉是通過降低細(xì)胞內(nèi)CREB的轉(zhuǎn)錄活性,造成Bcl-2表達(dá)水平的下調(diào)和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡的產(chǎn)生。進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn),蛋白激酶D1 (PKD1)在結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)與CREB存在直接的相互作用,且二者的相互作用在亞硒酸鈉處理后減弱。Western blot等結(jié)果則揭示了,PKD1的磷酸化水平直接影響CREB的轉(zhuǎn)錄活性及其靶基因Bcl-2的表達(dá)。通過使用PKD1激酶抑制劑和激活劑與亞硒酸鈉聯(lián)用,我們發(fā)現(xiàn)PKD1對CREB的調(diào)控依賴于自身的激酶活性,亞硒酸鈉是通過抑制PKD1的激酶活性來降低CREB的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而造成Bcl-2表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步通過免疫共沉淀、免疫熒光等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在亞硒酸鈉處理造成p38 MAPK激活并抑制PKD1/CREB/Bcl-2生存途徑,當(dāng)過表達(dá)p38 MAPK激酶缺失型質(zhì)�；�?qū)ζ浼っ富钚赃M(jìn)行抑制,亞硒酸鈉誘導(dǎo)的PKD1/CREB磷酸化抑制及Bcl-2表達(dá)下調(diào)過程被逆轉(zhuǎn)。同時(shí),western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果也都證實(shí)了,亞硒酸鈉處理的結(jié)直腸細(xì)胞中,p38 MAPK被激活并進(jìn)一步造成了PKD1/CREB/Bcl-2生存途徑的抑制和凋亡的產(chǎn)生。本課題在研究Bcl-2介導(dǎo)的線粒體凋亡過程中,還發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族中的Bad在亞硒酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中也扮演重要作用。線粒體蛋白的western blot檢測和免疫熒光檢測結(jié)果表明,亞硒酸鈉處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞中,Bad從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體并激活內(nèi)源性凋亡。我們發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白在Bad的胞漿儲(chǔ)存和線粒體轉(zhuǎn)位中扮演重要角色,免疫共沉淀和western blot檢測結(jié)果也表明了亞硒酸鈉處理造成了Bad的去磷酸化和從14-3-3蛋白的釋放。進(jìn)一步免疫熒光及免疫共沉淀結(jié)果揭示了,AKT介導(dǎo)了PKD1對Bad磷酸化水平的調(diào)控,造成了Bad的線粒體轉(zhuǎn)位。這些結(jié)果表明了,亞硒酸鈉還通過PKD1/AKT通路促使了Bad的轉(zhuǎn)位和線粒體凋亡的發(fā)生�；钚匝�(ROS)作為上游觸發(fā)因子,在亞硒酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中扮演非常重的角色。首先,本課題使用DCFH-DA探針檢測亞硒酸鈉處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞中ROS的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉處理的HCT116和SW80細(xì)胞中ROS水平在一定的時(shí)間范圍內(nèi)不斷升高。使用ROS的陽性對照試劑過氧化氫和ROS清除劑MnTMPyP與亞硒酸鈉聯(lián)合使用后進(jìn)行western blot檢測,結(jié)果表明ROS確實(shí)是p38MAPK/PKD1信號通路以及細(xì)胞凋亡的重要上游調(diào)控因子。為了驗(yàn)證體外細(xì)胞學(xué)研究的結(jié)果,本課題還建立了HCT116, SW480兩株細(xì)胞系的裸鼠移植瘤模型,并對亞硒酸鈉在體內(nèi)治對腫瘤的療效進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉能夠明顯抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長且無明顯毒性。我們又通過免疫組織化學(xué)和western blot等方法對腫瘤組織樣本中相應(yīng)細(xì)胞學(xué)的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果表明上述信號通路在腫瘤組織與體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)獲得相似的變化趨勢。研究結(jié)果進(jìn)一步支持了亞硒酸鈉在體內(nèi)、外同時(shí)具有誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)細(xì)胞凋亡的作用。我們的發(fā)現(xiàn)為亞硒酸鈉治療結(jié)直腸癌提供了全新的視角,也為亞硒酸對腫瘤的臨床治療提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2402758