發(fā)布時間：2019-01-01 16:46

【摘要】：[研究背景]氬氦冷凍消融術(shù)后滯留于原位的壞死腫瘤組織,可為體內(nèi)負(fù)載抗腫瘤樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)疫苗提供腫瘤抗原。已有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤冷凍術(shù)后,在瘤體內(nèi)注射DCs可加強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)并延長生存時間。氬氦冷凍消融術(shù)后腫瘤局部分成三個不同的區(qū)域,即中心壞死區(qū)、周邊損傷區(qū)及凍融區(qū)外正常組織。DCs注射位點的選擇應(yīng)兼顧靠近抗原釋放區(qū)域并利于歸巢兩個因素。將DCs注射于哪一區(qū)域治療效果更好,尚無相關(guān)報道。本研究的第一部分將篩選DCs的最佳給藥部位及免疫佐劑CpG-ODN對DCs歸巢的影響。誘導(dǎo)DCs分化成熟是DCs疫苗制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),已有研究證實腫瘤冷凍治療后,在瘤體內(nèi)同時注射DCs及免疫佐劑較單獨注射DCs效果更佳。但若要充分發(fā)揮DCs的抗原攝取功能,應(yīng)在一定時間內(nèi)維持DCs的未成熟狀態(tài),進(jìn)而在合適的時機給予免疫佐劑刺激其成熟。目前,尚未見關(guān)于免疫佐劑給藥時機與治療效果相關(guān)性及最佳給藥時機的報道。本研究的第二部分將篩選免疫佐劑C pG-ODN的最佳給藥時機。氬氦冷凍消融術(shù)主要用于晚期肺癌患者的治療,而目前所使用的晚期肺癌動物模型制備方法不一,可控性及可比性較差。本研究第三部分利用細(xì)胞團(tuán)技術(shù)制備了瘤體、轉(zhuǎn)移及瘤細(xì)胞數(shù)目等均可控性較強的小鼠晚期非小細(xì)胞肺(non-small cell lung cancer, NSCLC)癌模型，并運用該模型探討了氬氦冷凍消融術(shù)聯(lián)合體內(nèi)負(fù)載DCs疫苗對晚期NSCLC的治療效果。第一部分不同給藥部位及免疫佐劑CpG-ODN對DCs歸巢的影響[目的]探討氬氦冷凍消融術(shù)后DCs的不同給藥部位及免疫佐劑CpG-ODN對DCs歸巢的影響，篩選最佳DCs給藥部位。[材料與方法]1、體外擴增培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓來源的DCs;2、CFSE熒光標(biāo)記DCs；3、對荷瘤小鼠行氬氦冷凍消融治療；4、冷凍術(shù)后,將小鼠按給藥區(qū)域(中心區(qū)、周邊區(qū)、凍融區(qū)外、對側(cè)正常組織)隨機分成4組,每組內(nèi)再按注射DCs/DCs+CpG-ODN分成2個亞組；5、DCs/DCs+CpG-ODN注射后第1、3、7d流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry, FCM)檢測引流淋巴結(jié)中CFSE陽性細(xì)胞率并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,p0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)果]1、第6d收集體外培養(yǎng)的DCs,細(xì)胞狀態(tài)良好,數(shù)量可滿足實驗需求；2、CFSE標(biāo)記的DCs呈綠色熒光,細(xì)胞狀態(tài)良好；3、各組中CFSE陽性細(xì)胞率均呈先上升后下降的趨勢,于第3d達(dá)到峰值；4、各組中,DCs+CpG-ODN亞組的CFSE陽性細(xì)胞率均高于DCs亞組；5、將各組第3d CFSE陽性細(xì)胞率(峰值)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果表明,凍融區(qū)外注射組CFSE陽性細(xì)胞率均高于其他各組(p0.05)。第二部分CpG-ODN的給藥時機對氬氮冷凍消融術(shù)后體內(nèi)負(fù)載DCs疫苗的影響[目的]探討CpG-ODN的給藥時機對氬氮冷凍消融術(shù)后體內(nèi)負(fù)載DCs疫苗的影響,并篩選最佳給藥時機。[材料與方法]1、體外擴增培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓來源的DCs, FCM檢測CD80.CD83.CD86分子；2、對C57BL/6小鼠Lewis肺腺癌模型進(jìn)行氬氦冷凍消融治療：3、按免疫佐劑CpG-ODN的給藥時間,將120只荷瘤小鼠隨機分成4組,每組30只。所有荷瘤小鼠均在氬氦冷凍消融術(shù)后于凍融區(qū)外注射DCs。隨后,在DCs給藥后不同時間點(6、1 2、24h)于同一位置注射CpG-ODN,同時注射DCs+CpG-ODN(Oh)作為對照組；4、每組1 0只小鼠用于觀察生存時間,10只未經(jīng)治療的荷瘤鼠作為對照；5、治療后第7d,每組10只小鼠用于檢測血清中的細(xì)胞因子：IFN-γ,IL-12/IL-23p40,IL-4,IL-10,TNF-α:FCM檢測血CD~(3+)CD~(4+)T及CD~(3+)CD~(8+)T淋巴細(xì)胞亞群：6、氬氦冷凍消融術(shù)4w后,每組取10只小鼠,于小鼠對側(cè)肢體二次接種Lewis肺腺癌細(xì)胞；7、比較各組二次接種瘤動態(tài)生長狀況；8、二次接種腫瘤細(xì)胞4w后,脫頸處死小鼠，，取肺及脾臟,比較各組肺部腫瘤轉(zhuǎn)移情況：LDH法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞對Lewis肺腺癌細(xì)胞的體外殺傷作用。[結(jié)果]1、DCs培養(yǎng)第6天，F(xiàn)CM檢測示DCs低表達(dá)CD80.CD83.CD86分子,說明DCs處于未成熟狀態(tài)；2、Kaplan-Meier生存曲線顯示4個治療組(0h組、6h組、12h組及24h組)的生存率均高于未治療組；12h組的生存率高于其他三個治療組如0.05)；3、冷凍術(shù)后第7d,12h組血清IL-12、IFN-Y含量均高于其他三組(p0.05)；12h組的血清TNF-α含量高于Oh組和24h組(p0.05)；12h的血清TNF-α含量雖高于6h組,但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；12h組血清IL-4、IL-10含量低于0h組和24h組(p0.05)；12h組IL4、IL-10低于6h組,但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。4、治療后第7d,12h組的CD~(3+)CD~(4+)T與CD~(3+)CD~(8+)T比例均高于其他三組如0.05)；5、12h組二次接種腫瘤體積小于Oh組和24h組(p0.05)； 12h組腫瘤體積小于6h組,但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義婦0.05)；6、12h組肺臟的重量最輕,但略高于正常組,二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義如0.05)；12h組肺臟重量低于0h和24h組(p0.05)；與6h組相比,12h組肺臟重量偏低,但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；7、12h組脾淋巴細(xì)胞殺傷能力高于Oh組及24h組如0.05)；12h組脾淋巴細(xì)胞殺傷能力高于6h組,但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。第三部分氮氮冷凍消融術(shù)聯(lián)合體內(nèi)負(fù)載的DCs疫苗對晚期NSCLC治療效果的研究[目的]制備可控性較強小鼠晚期NSCLC模型；檢測氬氦冷凍消融術(shù)聯(lián)合體內(nèi)負(fù)載的DCs疫苗這一綜合治療方案對晚期NSCLC的治療效果。[材料與方法]1、Lewis肺腺癌細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代,第三代細(xì)胞用于制備細(xì)胞團(tuán)；2、將細(xì)胞團(tuán)移植于小鼠雙側(cè)腹部皮下；3、細(xì)胞團(tuán)移植后7d,小鼠用于實驗。治療前鼠尾靜脈注射Lewis肺腺癌細(xì)胞模擬NSCLC晚期腫瘤細(xì)胞的播散狀態(tài)：5、40只荷瘤小鼠隨機分成2組：氬氦冷凍治療組與綜合治療組(氬氦冷凍消融+DCs+CpG-ODN),每組20只,各組僅對右側(cè)病灶進(jìn)行治療；6、每組8只小鼠用于觀察生存時間；7、治療后第1、2、4、8w測量左側(cè)瘤體大小,比較兩組間的差異；8、治療后第1、2、4、8w取小鼠的肺組織,稱重比較肺部轉(zhuǎn)移情況。[結(jié)果]1、細(xì)胞團(tuán)技術(shù)制備的晚期小鼠肺癌模型在瘤體大小、轉(zhuǎn)移部位及播散瘤細(xì)胞數(shù)目等方面可控性均較強；2、綜合治療組小鼠生存率高于冷凍治療組p0.05)。其中綜合治療組的中位生存期為71.5d；冷凍治療組的的中位生存期為49.0d；3、在各時間點,綜合治療組的腫瘤體積均小于冷凍治療組p0.05)；4、在各時間點,綜合治療組肺臟重量均低于冷凍治療組p0.05)。[結(jié)論]1、氬氦冷凍消融術(shù)聯(lián)合體內(nèi)負(fù)載DCs疫苗可有效提高機體抗腫瘤免疫反應(yīng)：2、給藥部位可影響DCs的歸巢,凍融區(qū)外(瘤周)為DCs最佳給藥位點； 3、CpG-ODN可促進(jìn)DCs的歸巢；4、CpG-ODN的給藥時機對治療效果有影響，DCs給藥后12h為CpG-ODN的最佳給藥時機；5、與單純氬氦冷凍消融治療相比,該綜合治療方案對于晚期NSCLC的治療更佳。可延長生存時間,延緩新發(fā)轉(zhuǎn)移灶的形成,并降低已形成的轉(zhuǎn)移灶的生長速度,但不能使已形成的轉(zhuǎn)移灶縮小。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2397843