【摘要】：宮頸癌(Cervical cancer,CC)是女性常見惡性腫瘤,發(fā)病率在全世界女性腫瘤中位居第二位,僅次于乳腺癌。全世界每年新增病例約50萬,死亡病例約30萬,而我國CC發(fā)病率位居世界第二位,且發(fā)病年齡日漸年輕化,嚴(yán)重威脅全球女性生命健康。盡管目前對CC的診治取得了較大進(jìn)步,但CC患者的預(yù)后和死亡率并沒有得到明顯的改善。早期的CC患者通過手術(shù)治療可以達(dá)到較好的預(yù)后,而晚期CC患者5年的生存率只有50%左右,治療效果不佳。其它治療手段包括化療和放療,但均缺乏特異性,同時(shí)具有嚴(yán)重的毒副作用。因此深入探討CC發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制,尋求更好、更有效的治療方案對CC的臨床防治具有重大意義。e IF5A2基因是e IF5A家族的同源基因之一,定位在染色體3q26.2區(qū),在細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡等過程中扮演重要角色。既往研究表明,在卵巢癌、肝癌、膀胱癌及食管鱗狀細(xì)胞癌等多種實(shí)體瘤組織中存在e IF5A2異常表達(dá),并作為腫瘤惡性程度高的標(biāo)志物之一。而e IF5A2沉默能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,降低其侵襲轉(zhuǎn)移能力。近年研究發(fā)現(xiàn),e IF5A2在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著升高,且與FIGO分期、淋巴血管侵犯、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)高度相關(guān),但其在宮頸癌中的具體分子調(diào)控機(jī)制尚不明確,因此e IF5A2對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響仍需進(jìn)一步探索。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),Rho A/ROCK信號通路在多種腫瘤中持續(xù)性激活,且與腫瘤細(xì)胞生長、凋亡、侵襲遷移及惡性進(jìn)展密切相關(guān)。另有研究證實(shí),e IF5A2基因通過調(diào)控Rho A/ROCK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)介導(dǎo)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。此外,e IF5A2過表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的同時(shí)顯著激活Rho A/Rac1信號通路。表明e IF5A2可以通過調(diào)控Rho A/ROCK信號通路活性介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。但e IF5A2在宮頸癌中是否通過Rho A/ROCK信號通路影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性尚不清楚。本研究采用real-time PCR和western blot分析了e IF5A2表達(dá)與CC的相關(guān)性;并應(yīng)用RNA干擾技術(shù)降低e IF5A2在宮頸癌Hela細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)合MTT、流式細(xì)胞術(shù)、克隆形成、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell等實(shí)驗(yàn)觀察e IF5A2基因干擾對CC細(xì)胞增殖周期和遷移的影響;為探討相關(guān)的分子機(jī)制,本研究檢測了Rho A及ROCK在CC組織中的表達(dá),并通過構(gòu)建Rho A過表達(dá)載體及干擾片段研究Rho A異常表達(dá)對CC細(xì)胞增殖和遷移的影響;最后在e IF5A2基因干擾基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染Rho A過表達(dá)載體,深入探討e IF5A2基因?qū)ho A/ROCK信號通路的調(diào)控作用,明確e IF5A2基因在CC發(fā)病、進(jìn)展中的作用和具體分子機(jī)制。本研究結(jié)果旨在進(jìn)一步闡明CC的發(fā)病機(jī)理,并為宮頸癌臨床防治提供新型分子靶點(diǎn)和更多理論依據(jù)。1.e IF5A2在宮頸癌組織中的表達(dá)分析目的:分析e IF5A2在CC組織和癌旁正常組織中是否存在差異表達(dá),論證e IF5A2基因同CC發(fā)病存在相關(guān)性。方法:采集15對CC和對應(yīng)的癌旁正常組織樣本,real-time PCR技術(shù)檢測各樣本中e IF5A2 m RNA表達(dá),western blot技術(shù)檢測各樣本中e IF5A2蛋白表達(dá),分別從m RNA和蛋白水平分析e IF5A2與CC發(fā)病的關(guān)系。結(jié)果:同癌旁正常組織樣本比較,e IF5A2 m RNA和蛋白在CC組織樣本中的表達(dá)均顯著升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:成功證實(shí)e IF5A2在CC組織中異常高表達(dá),進(jìn)一步明確了e IF5A2可能成為人類腫瘤病理診斷的重要分子標(biāo)志和臨床治療的潛在分子靶點(diǎn)。并為應(yīng)用Real-time PCR或免疫組化技術(shù)分析e IF5A2在宮頸活檢組織中的表達(dá)進(jìn)行CC病理診斷奠定了一定的理論基礎(chǔ)。2.e IF5A2基因干擾對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的影響目的:明確e IF5A2基因干擾對Hela細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法:通過構(gòu)建e IF5A2干擾載體,轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并采用G418篩選e IF5A2穩(wěn)定干擾細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):空白對照組(Control)、陰性對照組(NC)和e IF5A2-sh RNA干擾組(she IF5A2)。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測e IF5A2干擾對Hela細(xì)胞增殖的影響;PI單染流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞周期變化;克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞增殖能力;劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移能力。結(jié)果:e IF5A2基因干擾后,MTT檢測結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力顯著下降(p0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示G0期細(xì)胞比例增加,S期和G2期細(xì)胞比例明顯減少(p0.05或p0.01);細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞克隆形成率顯著降低(p0.05);劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞遷移能力顯著減弱(p0.05)。結(jié)論:e IF5A2基因干擾能將Hela細(xì)胞阻滯于G0期,有效抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移。3.e IF5A2基因影響宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的分子機(jī)制目的:(1)分析Rho A表達(dá)與CC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,明確Rho A過表達(dá)或干擾對CC細(xì)胞增殖和遷移的影響。(2)明確e IF5A2基因干擾對CC細(xì)胞中Rho A/ROCK信號通路活性的影響以及e IF5A2基因是否通過調(diào)控Rho A/ROCK通路介導(dǎo)Hela細(xì)胞增殖和遷移。方法:(1)采集46例CC和34例宮頸炎組織樣本,Western blot技術(shù)檢測Rho A及ROCK在各組織樣本中的表達(dá),分析Rho A同患者年齡、腫瘤體積、HPV感染、FIGO分期、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體及孕激素受體的相關(guān)性;構(gòu)建Rho A過表達(dá)及干擾片段,分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):A空白對照組(Hela)、B空載對照組(Hela-Con)、C Rho A過表達(dá)組(Hela-Rho A+)、D陰性對照組(si RNA-Con)、E Rho A干擾組(si RNA-Rho A)。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測Rho A異常表達(dá)對CC細(xì)胞增殖的影響,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力變化。(2)western blot檢測Control組、NC組和she IF5A2組中Rho A、ROCKⅠ和ROCKⅡ的表達(dá),驗(yàn)證e IF5A2基因干擾對Rho A/ROCK通路具有調(diào)控作用后,構(gòu)建Rho A過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染e IF5A2基因穩(wěn)定干擾的Hela細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):NC組、she IF5A2組、she IF5A2+空載轉(zhuǎn)染組(Vector)和she IF5A2+Rho A過表達(dá)組(Rho A)。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測Rho A過表達(dá)對e IF5A2干擾細(xì)胞增殖能力的影響,劃痕實(shí)驗(yàn)分析各組細(xì)胞遷移能力變化。結(jié)果:(1)與對照組比較,Rho A、ROCKⅠ和ROCKⅡ在CC組織中的表達(dá)顯著增加(p0.05或p0.01),且同F(xiàn)IGO、血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān);Rho A過表達(dá)后,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力顯著增加(p0.05或p0.01),劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hela細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)(p0.01),而干擾Rho A能有效抑制細(xì)胞增殖和遷移(p0.05)。(2)western blot結(jié)果顯示e IF5A2基因干擾后Rho A、ROCKⅠ、ROCKⅡ的表達(dá)顯著降低(p0.05);在e IF5A2基因干擾基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染Rho A過表達(dá)載體后,同she IF5A2組比較,MTT和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示Rho A過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了e IF5A2干擾對Hela細(xì)胞的調(diào)控作用,Hela細(xì)胞的增殖和遷移能力均顯著上升,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:(1)Rho A在宮頸癌組織中異常高表達(dá),且同腫瘤臨床分期和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),Rho A過表達(dá)顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移。(2)e IF5A2基因通過激活Rho A/ROCK信號通路,增加Rho A、ROCKⅠ、ROCKII的表達(dá)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞遷移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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