【摘要】：實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤血管生成(Angiogenesis)密切相關(guān),腫瘤細(xì)胞的快速增殖所導(dǎo)致的相對(duì)缺氧,使腫瘤組織持續(xù)產(chǎn)生促血管生成因子,破壞了原有的促-/抗血管生成平衡的狀態(tài),導(dǎo)致腫瘤血管具有明顯的異質(zhì)性,使腫瘤微環(huán)境惡化,增加了惡性程度并降低治療效果。腫瘤血管已成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn),通過短暫的抗血管治療使異常的腫瘤血管正常化,聯(lián)合抗腫瘤治療,獲得了顯著的效果。目的:首先觀察納米金(Gold nanoparticles,AuNPs)聯(lián)合抗血管藥物重組人血管內(nèi)皮抑素(Recombinant human endostatin,rhES)的腫瘤靶向性,并檢測(cè)其所誘導(dǎo)的腫瘤血管正�；臅r(shí)間窗,以及是否可以提高常規(guī)化療的效果;其次觀察納米金對(duì)腫瘤血管正�；湍[瘤轉(zhuǎn)移的影響,并探討其相關(guān)機(jī)制;最后觀察血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)在腫瘤血管正�；^程中的變化趨勢(shì),以確定其是否可以作為一種血管正常化的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。方法:第一章,通過紫外分光光度法、動(dòng)態(tài)激光散射和場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡鑒定納米金和重組人血管內(nèi)皮抑素結(jié)合前后的特性,通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)藥物的靶向性,血管正常化過程中周細(xì)胞覆蓋率(α-SMA/CD31)、血流灌注(FITC-Lectin/CD31)、血管通透性(FITC-Dextran/CD31)和腫瘤組織缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表達(dá);在正�；瘏^(qū)間內(nèi)給予5-FU(40 mg/kg),通過高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)檢測(cè)腫瘤組織中5-FU的濃度,并觀測(cè)腫瘤大小和荷瘤模型的中位生存時(shí)間(Median survival time,MST)。第二章,通過C57BL/6后肢足墊注射B16F10細(xì)胞建立黑色素瘤荷瘤模型,給予納米金(1mg/kg)處理,通過免疫熒光檢測(cè)血管通透性和灌注率,利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、組織缺氧程度(哌莫硝唑染色法)和組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體(VEGFR2);通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)納米金對(duì)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響,通過CCK-8法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞活性的影響,利用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2),c-Myc,波形蛋白(Vimentin),E-鈣黏蛋白(E-Cadherin),緊密連接蛋白(ZO-1)和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)在腫瘤細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的變化,利用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)檢測(cè)EMT相關(guān)基因表達(dá)變化。第三章,通過皮下注射SW620細(xì)胞至Balb/c裸鼠皮下建立結(jié)直腸癌荷瘤模型,免疫熒光和免疫組化確定腫瘤血管正常化的出現(xiàn),結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)外周血中人血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)隨時(shí)間窗變化的趨勢(shì)。結(jié)果:首先納米金與重組人血管內(nèi)皮抑素結(jié)合后明顯提高了后者在腫瘤內(nèi)的劑量,并且維持了較長(zhǎng)的時(shí)間。免疫熒光顯示用藥后的第4天和第8天腫瘤血管呈現(xiàn)正常化的表現(xiàn):血管周圍α-SMA覆蓋增加,FITC-Lectin灌注增加,FITC-Dextran在血管外周沉積減少,腫瘤組織HIF-1α表達(dá)降低,在正�；瘯r(shí)間窗內(nèi)給予5-FU治療,提高了5-FU在腫瘤內(nèi)的濃度,明顯減小了腫瘤體積,延長(zhǎng)了荷瘤模型的中位生存時(shí)間。其次,單純使用納米金增加了FITC-Lectin在腫瘤組織中的灌注,減少了FITC-Dextran的滲出,哌莫硝唑染色顯示處理組的缺氧程度緩解;免疫組化顯示組織中Vimentin的表達(dá)降低,而E-Cadherin的表達(dá)升高,證明對(duì)EMT過程具有抑制作用。納米金降低了腫瘤組織中VEGF的表達(dá),但VEGFR2未見明顯抑制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明納米金抑制了腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,但CCK-8結(jié)果顯示兩種細(xì)胞的活性并未受影響;蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)納米金抑制內(nèi)皮細(xì)胞MMP2表達(dá),促進(jìn)ZO-1的表達(dá),抑制了腫瘤細(xì)胞MMP2、c-Myc和SPARC的表達(dá),逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中Vimentin和E-Cadherin的比值。RT-qPCR結(jié)果顯示與EMT相關(guān)的Snail-1,Snail-2,Twist-1,ZEB-1和ZEB-2表達(dá)下降。最后,通過ELISA我們發(fā)現(xiàn)外周血中TSP-1在腫瘤血管正�；陂g明顯的降低,并且該趨勢(shì)與腫瘤血管正�；臅r(shí)間窗相符合。結(jié)論:1.納米金可作為藥物載體靶向輸送重組人血管內(nèi)皮抑素進(jìn)入腫瘤組織;2.納米金結(jié)合重組人血管內(nèi)皮抑素短暫治療促進(jìn)了腫瘤血管正�；�,增加了化療效果,并且具有明顯的時(shí)間相關(guān)性;3.納米金通過下調(diào)SPARC、MMP-2和c-Myc以及相關(guān)基因的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生,并降低了黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移。4.納米金通過下調(diào)MMP-2抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成能力,并通過上調(diào)ZO-1的表達(dá)增強(qiáng)血管壁的完整性;5.血漿中TSP-1的變化與腫瘤血管正�；瘯r(shí)間窗內(nèi)缺氧程度的變化趨勢(shì)相符,有希望成為預(yù)測(cè)腫瘤血管正常化的一個(gè)指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R73-36

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3 戴e，

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