【摘要】：膠原蛋白是人體最豐富的蛋白質(zhì),對生命的生理功能起著多重作用。近年來研究主要突出了膠原蛋白在多種癌癥中的重要性,其主要應(yīng)用于癌癥轉(zhuǎn)移、血管生成、促細(xì)胞生長和癌癥檢測靶向與治療等。雖然膠原蛋白對生命有著若干的優(yōu)點(diǎn),但是在現(xiàn)代生活中,機(jī)體各種各樣的癌癥如結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌等發(fā)病的種類卻在逐年增加。經(jīng)研究,這些癌癥有著一個(gè)共同的酶(肝再生磷酸酶-3,PRL-3)出現(xiàn)了過表達(dá),促進(jìn)了癌癥轉(zhuǎn)移和惡化,也導(dǎo)致了體內(nèi)組織膠原蛋白出現(xiàn)迅速的減少和降解,從而加重了病人的病情,增加了治療過程的難度。由于膠原蛋白和PRL-3都對人體很重要,若能對重組膠原蛋白和PRL-3基本性質(zhì)存在的問題進(jìn)行進(jìn)一步研究,就可以為癌癥治療和藥物研發(fā)提供依據(jù),并為了解二者在癌癥病發(fā)過程中的變化提供參考,從而達(dá)到為癌癥病患量體裁衣的治療目的。因此,進(jìn)一步研究重組類人膠原蛋白在分離純化過程中遇到的問題,可以使其能更好的應(yīng)用于臨床癌癥的研究,同時(shí)研究因PRL-3異常磷酸化而導(dǎo)致癌癥和免疫缺陷的功能性特征不清楚這一關(guān)鍵問題就顯得尤為重要。本論文的主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面：1)本文提出用溫和的多元醇添加劑修飾類人膠原蛋白(Human-like Collagen, HLC),然后再用陽離子交換色譜進(jìn)行分離純化。通過選擇不同多元醇修飾HLC,找到最佳修飾HLC的多元醇添加劑,之后對離子色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。多元醇修飾HLC不僅能減少三螺旋膠原蛋白因分子間作用力的疏水鍵而形成的多聚物,也能阻止HLC在純化過程中形成多聚物,打破了膠原蛋白在分離純化過程中因分子問作用力形成多聚物而移除雜質(zhì)困難的僵局。將獲得的最佳多元醇1,2-丙二醇作為HLC的修飾劑,不僅能獲得最佳的分離效果,還可通過多次進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)色譜柱的高效利用。最后,用圓二色譜、分析型凝膠過濾色譜和透射電鏡等分析了多元醇修飾HLC三螺旋結(jié)構(gòu)的性質(zhì)和蛋白形態(tài)等。2)通過Pierce High-Capacity Endotoxin Removal Resin對重組HLC進(jìn)行內(nèi)毒素的移除�；蚬こ滔轮亟M蛋白也有一個(gè)棘手的問題就是內(nèi)毒素的污染。這也是目前重組蛋白難以攻克的難題之一。因此,在對HLC內(nèi)毒素移除中,選用吸附內(nèi)毒素多且成本不高的High-Capactiy Endotoxin Removal Resin樹脂。盡管此樹脂提供了參考說明,但是對HLC中內(nèi)毒素的移除效果不佳。為了更好的移除HLC的內(nèi)毒素,本論文中選用了溫和的Tris-醋酸緩沖液(TA),用該樹脂對HLC進(jìn)行內(nèi)毒素的移除,并對Tris-醋酸緩沖液條件和可能影響內(nèi)毒素移除的條件做了優(yōu)化。以最大程度移除內(nèi)毒素且保證HLC不變性聚集為必須條件,同時(shí)以不引進(jìn)難以移除或者有毒的物質(zhì)如Trito、Tween等為基本條件移除內(nèi)毒素,實(shí)現(xiàn)了高效率移除內(nèi)毒素及高回收率的蛋白,并為后續(xù)的生物產(chǎn)品的制備和研發(fā)提供原材料。3)對體外調(diào)控PRL-3磷酸酶磷酸化的活性進(jìn)行研究。已經(jīng)證實(shí)在多種腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移癌癥中涉及到PRLs的酶活性,其多種癌癥與PRL-3過表達(dá)相關(guān),但是在多種轉(zhuǎn)移癌中PRL-3磷酸酶磷酸化的活性調(diào)控還不清楚。因此,在本論文中,主要研究了體外PRL-3磷酸酶磷酸化活性的調(diào)控,通過不同條件下的熒光偏振、核苷酸及核苷酸類似物的篩選及其質(zhì)譜分析磷酸化肽段等手段研究了如何調(diào)控PRL-3磷酸酶的磷酸化活性。這一研究不僅能為癌癥藥物抑制劑提供一個(gè)目標(biāo),也能為進(jìn)一步研究其他的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatase, PTP)的磷酸化機(jī)理提供有利的證據(jù)。4)通過對半胱氨酸磷酸化調(diào)控研究了PRL-3與周期素M3(CNNM3)胱硫醚β合成酶(CBS)對域(pair domains)復(fù)合物之間的相互作用。盡管PRLs的磷酸酶活性機(jī)理可以為治療提供潛在的依據(jù),但是在能量代謝和腫瘤發(fā)展中,PRL和CNNM的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體可以相互作用,并通過Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制CNNM。本文通過半胱氨酸的磷酸化來研究PRL-3與CNNM3 CBS對域的復(fù)合物形成,并通過二者復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的研究,探尋二者相互作用下的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合關(guān)系,再通過對二者晶體結(jié)構(gòu)的分析,得到有力的結(jié)合位點(diǎn)。利用二者結(jié)構(gòu)中的磷酸化位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)為下一步藥物的研發(fā)和對癌癥的治療檢測提供有利的依據(jù)。5)研究純化后HLC與PRL-3在癌癥細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的相互關(guān)系。通過劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞裂解后進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn)來研究重組的HLC是否會抑制PRL-3的過表達(dá),從而為HLC應(yīng)用于因PRL-3過表達(dá)導(dǎo)致的癌癥提供藥物研發(fā)和治療,并通過HLC對機(jī)體膠原蛋白的外源補(bǔ)充來減輕或者抑制因PRL-3過表達(dá)引起癌癥的迅速轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O629.73;R730.5

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本文編號：2395930