【摘要】：膠原蛋白是人體最豐富的蛋白質(zhì),對生命的生理功能起著多重作用。近年來研究主要突出了膠原蛋白在多種癌癥中的重要性,其主要應用于癌癥轉(zhuǎn)移、血管生成、促細胞生長和癌癥檢測靶向與治療等。雖然膠原蛋白對生命有著若干的優(yōu)點,但是在現(xiàn)代生活中,機體各種各樣的癌癥如結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌等發(fā)病的種類卻在逐年增加。經(jīng)研究,這些癌癥有著一個共同的酶(肝再生磷酸酶-3,PRL-3)出現(xiàn)了過表達,促進了癌癥轉(zhuǎn)移和惡化,也導致了體內(nèi)組織膠原蛋白出現(xiàn)迅速的減少和降解,從而加重了病人的病情,增加了治療過程的難度。由于膠原蛋白和PRL-3都對人體很重要,若能對重組膠原蛋白和PRL-3基本性質(zhì)存在的問題進行進一步研究,就可以為癌癥治療和藥物研發(fā)提供依據(jù),并為了解二者在癌癥病發(fā)過程中的變化提供參考,從而達到為癌癥病患量體裁衣的治療目的。因此,進一步研究重組類人膠原蛋白在分離純化過程中遇到的問題,可以使其能更好的應用于臨床癌癥的研究,同時研究因PRL-3異常磷酸化而導致癌癥和免疫缺陷的功能性特征不清楚這一關(guān)鍵問題就顯得尤為重要。本論文的主要內(nèi)容包括以下幾個方面：1)本文提出用溫和的多元醇添加劑修飾類人膠原蛋白(Human-like Collagen, HLC),然后再用陽離子交換色譜進行分離純化。通過選擇不同多元醇修飾HLC,找到最佳修飾HLC的多元醇添加劑,之后對離子色譜條件進行優(yōu)化。多元醇修飾HLC不僅能減少三螺旋膠原蛋白因分子間作用力的疏水鍵而形成的多聚物,也能阻止HLC在純化過程中形成多聚物,打破了膠原蛋白在分離純化過程中因分子問作用力形成多聚物而移除雜質(zhì)困難的僵局。將獲得的最佳多元醇1,2-丙二醇作為HLC的修飾劑,不僅能獲得最佳的分離效果,還可通過多次進樣實現(xiàn)色譜柱的高效利用。最后,用圓二色譜、分析型凝膠過濾色譜和透射電鏡等分析了多元醇修飾HLC三螺旋結(jié)構(gòu)的性質(zhì)和蛋白形態(tài)等。2)通過Pierce High-Capacity Endotoxin Removal Resin對重組HLC進行內(nèi)毒素的移除。基因工程下重組蛋白也有一個棘手的問題就是內(nèi)毒素的污染。這也是目前重組蛋白難以攻克的難題之一。因此,在對HLC內(nèi)毒素移除中,選用吸附內(nèi)毒素多且成本不高的High-Capactiy Endotoxin Removal Resin樹脂。盡管此樹脂提供了參考說明,但是對HLC中內(nèi)毒素的移除效果不佳。為了更好的移除HLC的內(nèi)毒素,本論文中選用了溫和的Tris-醋酸緩沖液(TA),用該樹脂對HLC進行內(nèi)毒素的移除,并對Tris-醋酸緩沖液條件和可能影響內(nèi)毒素移除的條件做了優(yōu)化。以最大程度移除內(nèi)毒素且保證HLC不變性聚集為必須條件,同時以不引進難以移除或者有毒的物質(zhì)如Trito、Tween等為基本條件移除內(nèi)毒素,實現(xiàn)了高效率移除內(nèi)毒素及高回收率的蛋白,并為后續(xù)的生物產(chǎn)品的制備和研發(fā)提供原材料。3)對體外調(diào)控PRL-3磷酸酶磷酸化的活性進行研究。已經(jīng)證實在多種腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移癌癥中涉及到PRLs的酶活性,其多種癌癥與PRL-3過表達相關(guān),但是在多種轉(zhuǎn)移癌中PRL-3磷酸酶磷酸化的活性調(diào)控還不清楚。因此,在本論文中,主要研究了體外PRL-3磷酸酶磷酸化活性的調(diào)控,通過不同條件下的熒光偏振、核苷酸及核苷酸類似物的篩選及其質(zhì)譜分析磷酸化肽段等手段研究了如何調(diào)控PRL-3磷酸酶的磷酸化活性。這一研究不僅能為癌癥藥物抑制劑提供一個目標,也能為進一步研究其他的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatase, PTP)的磷酸化機理提供有利的證據(jù)。4)通過對半胱氨酸磷酸化調(diào)控研究了PRL-3與周期素M3(CNNM3)胱硫醚β合成酶(CBS)對域(pair domains)復合物之間的相互作用。盡管PRLs的磷酸酶活性機理可以為治療提供潛在的依據(jù),但是在能量代謝和腫瘤發(fā)展中,PRL和CNNM的離子轉(zhuǎn)運體可以相互作用,并通過Mg2+轉(zhuǎn)運體抑制CNNM。本文通過半胱氨酸的磷酸化來研究PRL-3與CNNM3 CBS對域的復合物形成,并通過二者復合物晶體結(jié)構(gòu)的研究,探尋二者相互作用下的結(jié)合位點和結(jié)合關(guān)系,再通過對二者晶體結(jié)構(gòu)的分析,得到有力的結(jié)合位點。利用二者結(jié)構(gòu)中的磷酸化位點和結(jié)合位點為下一步藥物的研發(fā)和對癌癥的治療檢測提供有利的依據(jù)。5)研究純化后HLC與PRL-3在癌癥細胞實驗中的相互關(guān)系。通過劃痕實驗和細胞裂解后進行Western Blotting實驗來研究重組的HLC是否會抑制PRL-3的過表達,從而為HLC應用于因PRL-3過表達導致的癌癥提供藥物研發(fā)和治療,并通過HLC對機體膠原蛋白的外源補充來減輕或者抑制因PRL-3過表達引起癌癥的迅速轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O629.73;R730.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 邢建宇;范代娣;薛文嬌;朱晨輝;馬曉軒;馬戎;;類人膠原蛋白的聚集行為與固定化方法[J];化學工程;2010年06期

2 俞園園;;類人膠原蛋白-銅螯合物的制備及相關(guān)性質(zhì)研究[J];化學與生物工程;2013年07期

3 俞園園;;類人膠原蛋白-鈣螯合物的制備及相關(guān)研究[J];河南科學;2013年08期

4 郭佳慶;駱艷娥;范代娣;高鵬飛;馬曉軒;朱晨輝;;響應面方法分析代謝產(chǎn)物對類人膠原蛋白表達的影響(英文)[J];Chinese Journal of Chemical Engineering;2010年05期

5 王曉軍,范代娣;金屬螯合親和層析在純化重組類人膠原蛋白中的應用[J];高�；瘜W工程學報;2005年03期

6 駱艷娥,范代娣,劉樹文,馬曉軒,王小剛;類人膠原蛋白3種測定方法的比較[J];西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版);2005年03期

7 俞園園;范代娣;;類人膠原蛋白人工骨的制備及表征[J];化學與生物工程;2008年07期

8 關(guān)瑜;陳光;陳歡;李旭媛;;類人膠原蛋白表達的優(yōu)化與純化的研究[J];食品工業(yè)科技;2012年14期

9 張兮;范代娣;花秀夫;駱艷娥;馬曉軒;;基因重組大腸桿菌生產(chǎn)類人膠原蛋白補氮策略優(yōu)化研究[J];化學與生物工程;2006年01期

10 馬曉軒;范代娣;王曉軍;駱艷娥;米鈺;;批量離子交換層析和凝膠過濾層析在類人膠原蛋白I純化中的應用[J];離子交換與吸附;2006年01期

相關(guān)會議論文 前1條

1 樊昕;韓悅;郄金鵬;姚美華;岳丹霞;孫衛(wèi)新;楊蓉婭;;類人膠原蛋白對女性健康者皮膚作用的定量評價[A];中華醫(yī)學會第十八次全國皮膚性病學術(shù)年會論文匯編[C];2012年

相關(guān)重要報紙文章 前5條

1 ;美麗源泉類人膠原蛋白,造福全球億萬女性[N];中國婦女報;2009年

2 本報記者 李軍;類人膠原蛋白:成就“美麗”事業(yè)[N];中國化工報;2014年

3 記者 聶益南　邊峰;類人膠原蛋白在西安實現(xiàn)量產(chǎn)[N];中華工商時報;2010年

4 董勤;巾幗豪杰[N];陜西日報;2006年

5 本報記者 車喜韻;走進陜西醫(yī)械生產(chǎn)企業(yè)[N];陜西日報;2011年

相關(guān)博士學位論文 前6條

1 張會芝;類人膠原蛋白分離純化和肝再生磷酸酶-3功能特性的研究[D];西北大學;2016年

2 邢建宇;類人膠原蛋白的相互作用研究及應用[D];西北大學;2011年

3 馬曉軒;基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白及其分離純化[D];西北大學;2006年

4 馬茂;殼聚糖—類人膠原蛋白海綿的生物相容性及止血效果研究[D];西北大學;2008年

5 米鈺;重組菌生產(chǎn)類人膠原蛋白發(fā)酵過程建模與控制[D];西北大學;2006年

6 駱艷娥;重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白的過程優(yōu)化研究[D];西北大學;2005年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 郭紅麗;重組類人膠原蛋白基因工程菌發(fā)酵動力學[D];南京理工大學;2009年

2 王德偉;類人膠原蛋白的生物相容性研究[D];西北大學;2006年

3 段志廣;類人膠原蛋白止血海綿的性能研究[D];西北大學;2008年

4 張兮;重組類人膠原蛋白表達體系過程優(yōu)化[D];西北大學;2006年

5 高力虎;重復序列類人膠原蛋白表達載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的分泌表達[D];南京理工大學;2007年

6 段明瑞;重組類人膠原蛋白基因工程菌發(fā)酵及動力學研究[D];西北大學;2002年

7 王曉軍;重組類人膠原蛋白HCB1分離純化研究[D];西北大學;2003年

8 王皓;類人膠原蛋白在大腸桿菌中的高效表達及其抗氧化活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2013年

9 王淑英;重組類人膠原蛋白離子交換分離及動力學的研究[D];西北大學;2007年

10 張馳;重組大腸桿菌生產(chǎn)類人膠原蛋白Ⅲ發(fā)酵條件優(yōu)化與分離純化研究[D];西北大學;2009年

，

本文編號：2395930