【摘要】：背景腦膠質(zhì)瘤,廣義上是指所有神經(jīng)上皮細(xì)胞來源的腫瘤,而組織病理學(xué)上則常指來源于各類膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤,是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,預(yù)后很差,而且多見于青壯年患者,給整個(gè)社會(huì)和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)。目前腦膠質(zhì)瘤治療需要多學(xué)科合作的綜合治療,包括顯微手術(shù)切除為主,術(shù)后輔助放化療。但即便采用了手術(shù)、放療、化療等綜合治療手段,由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對放療和化療不敏感,其復(fù)發(fā)率和死亡率仍然居高不下。因此,開展其他行之有效的替代或者輔助治療手段對改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后和生存質(zhì)量具有重要意義。氬氦靶向冷凍手術(shù)治療技術(shù)(簡稱氬氦刀)是近些年源自美國引進(jìn)的一種超低溫冷凍技術(shù)。作為一種局部冷凍消融技術(shù),由于其能密切監(jiān)控冷凍溫度、冷凍范圍,以及對周圍組織可以實(shí)時(shí)測溫的優(yōu)點(diǎn),能夠更好的保留更多正常腦組織,而且對腦功能區(qū)膠質(zhì)瘤或者靠近大的、重要血管解剖位置的膠質(zhì)瘤、復(fù)發(fā)或殘留的膠質(zhì)瘤均可以治療。氬氦刀能引起細(xì)胞膜破裂,腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗原大量釋放,從而激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。目前隨著腫瘤免疫學(xué)的巨大進(jìn)步,腫瘤免疫治療在許多實(shí)體腫瘤的治療中取得了令人鼓舞的成果,特別是惡性黑色素瘤。氬氦冷凍消融不僅可摧毀局部腫瘤組織,還可引起腫瘤局部和全身的免疫反應(yīng),消滅殘留或復(fù)發(fā)的腫瘤。有研究報(bào)道,氬氦刀治療除了直接物理破壞腫瘤細(xì)胞,還能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟,從而激活機(jī)體的細(xì)胞免疫功能,實(shí)現(xiàn)了局部微創(chuàng)治療和免疫治療的完美結(jié)合。盡管氬氦冷凍消融治療可有效誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng),但由于腫瘤患者常處于抗腫瘤免疫反應(yīng)受抑制狀態(tài),因此有必要通過免疫增強(qiáng)劑來擴(kuò)大機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng),合理選擇免疫調(diào)節(jié)劑決定著冷凍原位腫瘤疫苗能否在臨床應(yīng)用中得到推廣。有研究表明GM-CSF可增加腫瘤局部DCs數(shù)量、淋巴器官中DCs數(shù)量及活化比例,誘導(dǎo)脾臟細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應(yīng),促進(jìn)機(jī)體免疫狀態(tài)向Th1反應(yīng)轉(zhuǎn)化。目前GM-CSF作為免疫增強(qiáng)劑的GVAX腫瘤疫苗,在黑色素瘤、前列腺癌、NSCLC和腎癌等疾病中進(jìn)行了大量臨床試驗(yàn),結(jié)果表明GM-CSF能作為一個(gè)有效的免疫增強(qiáng)劑刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。同時(shí),GM-CSF生物性能穩(wěn)定,臨床應(yīng)用安全有效,是一個(gè)頗具應(yīng)用潛能的免疫調(diào)節(jié)劑。在腦膠質(zhì)瘤治療中,有部分手術(shù)后殘留或者復(fù)發(fā)而不愿行手術(shù)治療的患者,或者位于重要的大血管附近膠質(zhì)瘤,氬氦冷凍消融病灶可由于血流對血管的保護(hù)作用而避免血管損傷。對于此類患者,氬氦冷凍治療為其提供了一個(gè)有效的選擇。但該技術(shù)方法在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用還不夠成熟,缺乏必要的基礎(chǔ)研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。另外GM-CSF是否可以有效增強(qiáng)膠質(zhì)瘤小鼠的氬氦冷凍免疫反應(yīng),目前尚沒有實(shí)驗(yàn)報(bào)道。本課題通過在C57BL/6小鼠背部成功建立GL261膠質(zhì)瘤模型,在局部行氬氦冷凍治療,同時(shí)聯(lián)合免疫增強(qiáng)劑GM-CSF,分析探討兩者聯(lián)合治療膠質(zhì)瘤的可行性和有效性,以及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；通過動(dòng)態(tài)觀察從小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞免疫功能的時(shí)間動(dòng)態(tài)變化,并與單純氬氦冷凍治療、單純GM-CSF注射治療兩種單一治療方式相對比,希望探明氬氦冷凍局部治療與全身免疫反應(yīng)之間內(nèi)在聯(lián)系,以及脾臟細(xì)胞免疫功能的變化規(guī)律,進(jìn)一步探究使用患者自身腫瘤抗原,在體內(nèi)增加DCs對抗原的攝取,從而形成自身DCs疫苗,在自體內(nèi)誘導(dǎo)出特異性抗腫瘤免疫反應(yīng),希望實(shí)現(xiàn)DCs疫苗的個(gè)體化,為臨床應(yīng)用提供一個(gè)初步理論參考。第一章C57BL/6小鼠GL261小鼠腦膠質(zhì)瘤模型建立及氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療的生存期觀察研究目的觀察氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療荷膠質(zhì)瘤小鼠的療效。研究內(nèi)容(1)荷膠質(zhì)瘤小鼠模型的建立；(2)觀察不同治療方案對膠質(zhì)瘤小鼠的治療效果,包括一般情況及腫瘤大小等；(3)荷膠質(zhì)瘤小鼠生存期。研究方法：1、荷膠質(zhì)瘤小鼠模型建立及分組：GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞株復(fù)蘇、傳代后,制備單細(xì)胞懸液,種植于C57BL/6小鼠背部靠近臀部處皮下,建立小鼠膠質(zhì)瘤模型；腫瘤組織行HE染色進(jìn)行腫瘤組織的形態(tài)學(xué)觀察,確定荷膠質(zhì)瘤小鼠模型的成功建立；造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型對照組、單純GM-CSF注射組、單純氬氦冷凍組和氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組。2、觀察各組小鼠腫瘤大小及荷瘤小鼠的生存期：接種后每天密切觀察小鼠活動(dòng)情況：小鼠進(jìn)食是否正常,毛色是否光滑整齊,背部接種部位是否膨隆；接種后每3天測量一次小鼠的體重,隔日觀察小鼠皮下膠質(zhì)瘤的成瘤及生長情況,根據(jù)測量的腫瘤最大長徑A和最小寬徑B,計(jì)算腫瘤的體積(其體積為A×B2/2)；記錄小鼠生存時(shí)間,以70天為觀察終點(diǎn),繪制生長曲線圖。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s表示。各個(gè)治療組小鼠的生存時(shí)間記錄為：平均生存時(shí)間(天)±標(biāo)準(zhǔn)差,采用Kaplan-Meier生存分析法描繪各個(gè)治療組小鼠生存分析曲線, 組間比較采用log-rank檢驗(yàn),多重比較采用Bonferroni校正,都與Cryo+GM-CSF組比較, 共三次, 校正后檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05/3=0.0167；各治療組小鼠腫瘤體積的變化采用重復(fù)測量的方差分析,各時(shí)間點(diǎn)之間的多重比較采用LSD方法。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1、GL261細(xì)胞呈貼壁生長,狀態(tài)良好；小鼠接種膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,進(jìn)食未見明顯異常,活動(dòng)稍受限,毛發(fā)光澤度較前稍差,接種部位隨時(shí)間延長逐漸膨隆,表面無破潰、出血；種植腫瘤細(xì)胞后第14-16天,肉眼可見小鼠背部接種部位明顯膨隆,腫塊大小約為2.5-3.0cm3,表面無破潰；腫瘤組織光學(xué)顯微鏡下觀察,腫瘤細(xì)胞呈圓形、梭形或多角形,排列紊亂,細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則形,染色質(zhì)深染,病理性核分裂象活躍,局部可見壞死區(qū)域；2、動(dòng)態(tài)觀察不同治療組荷瘤小鼠腫瘤大小的變化：①各種不同治療方案下動(dòng)態(tài)觀察腫瘤大小變化：模型對照組：對照組小鼠背部腫瘤隨時(shí)間逐漸增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.287,P0.001);單純GM-CSF注射組：與治療前相比較,治療后小鼠背部腫瘤亦隨時(shí)間逐漸增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.179,P=0.007)；單純氬氦冷凍組：與治療前相比較,治療后7天腫瘤稍有增大,但隨著時(shí)間繼續(xù)延長,腫瘤逐漸縮小,與治療前比較,各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.555,P0.001);氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組：與治療前相比較,治療后7天腫瘤稍有增大,但隨著時(shí)間繼續(xù)延長,腫瘤逐漸縮小,與治療前比較,各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.071,P0.001)。②同一時(shí)間點(diǎn)下不同治療方案對腫瘤大小影響：治療前,不同治療組之間腫瘤大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.453,P=0.075)；治療后7天,各治療組小鼠腫瘤均較模型對照組小,不同治療組之間腫瘤大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.527,P=0.069)；治療后14天,各治療組小鼠腫瘤均較模型對照組小,聯(lián)合治療組腫瘤最小,其次是單純氬氦冷凍組,再次為單純GM-CSF注射組,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=114.948,P0.001)；治療后21天,各治療組小鼠腫瘤均較模型對照組小,聯(lián)合治療組腫瘤最小,其次是單純氬氦冷凍組,再次為單純GM-CSF注射組,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=165.392,P0.001)。各組間效應(yīng)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.612,P0.001),各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.934,P=0.014),兩者之間具有交互效應(yīng)(F=20.354,P0.001)。總結(jié)：單純GM-CSF注射治療可以延緩小鼠膠質(zhì)瘤生長,但不能殺滅腫瘤,抑制腫瘤生長；單純氬氦冷凍治療可以在一定程度上減小了腫瘤的體積；而二者聯(lián)合治療后可以呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng),明顯抑制了腫瘤的生長3、各種不同治療方案對荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響：各組小鼠平均生存時(shí)間(天)分別為：模型對照組38.10±1.77,單純GM-CSF注射組43.40±2.14,單純氬氦冷凍組63.80±2.77,氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組69.80±0.19,氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF組小鼠平均生存時(shí)間最長,其次是單純氬氦冷凍組,單純GM-CSF注射組和模型對照組小鼠均未存活至觀察終點(diǎn),各組生存時(shí)間相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=47.300,P0.001)。結(jié)論：1、荷膠質(zhì)瘤小鼠模型成功建立：該方法可以成功建立C57BL/6小鼠GL261膠質(zhì)瘤模型,形成的腫瘤組織光鏡下觀察符合惡性膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為。建立的膠質(zhì)瘤模型生長期符合預(yù)期,種植腫瘤細(xì)胞后第14-16天,肉眼可見小鼠背部接種部位明顯膨隆,腫塊大小約為2.5-3.0cm3,表面無破潰。適合行各種治療干預(yù)。2、不同治療方案對膠質(zhì)瘤小鼠的治療效果：單純GM-CSF注射治療可以延緩小鼠膠質(zhì)瘤生長,但不能殺滅腫瘤,抑制腫瘤生長；單純氬氦冷凍治療可以在一定程度上減小了腫瘤的體積；而二者聯(lián)合治療后可以呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng),明顯抑制了腫瘤的生長。3、氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療可以延長荷膠質(zhì)瘤小鼠的生存期。第二章氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療對荷腦膠質(zhì)瘤小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響研究目的探討氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療荷膠質(zhì)瘤小鼠是否可通過引起脾臟DCs活化來引起特異性抗腫瘤免疫,為進(jìn)一步探索膠質(zhì)瘤免疫治療提供一個(gè)理論依據(jù)。研究內(nèi)容(1)荷膠質(zhì)瘤小鼠模型的建立；(2)動(dòng)態(tài)觀察不同治療方案治療前后小鼠脾臟DCs數(shù)量變化及活化情況,明確氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF是否可以有效活化DCs從而將腫瘤特異性抗原呈遞給T細(xì)胞,激活機(jī)體抗腫瘤免疫以殺死膠質(zhì)瘤細(xì)胞。研究方法1、荷膠質(zhì)瘤小鼠模型建立及分組：將成功種植GL261細(xì)胞并成瘤的荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型對照組、單純GM-CSF注射組、單純氬氦冷凍組和氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組,每組20只。各組動(dòng)物分干預(yù)治療前、治療后7、14、21d共4個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在各組內(nèi)隨機(jī)抽取5只小鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。2、免疫組織化學(xué)法檢測各治療組在治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)DCs表面標(biāo)記CDllc在脾臟的表達(dá)情況。3、流式細(xì)胞術(shù)檢測各治療組在治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)的脾臟DCs的活化情況。4、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各治療組在治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)脾臟細(xì)胞IFN-γ的分泌水平。5、LDH實(shí)驗(yàn)檢測治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)脾臟細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)的殺傷活性。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以x±s表示。不同組間不同時(shí)間點(diǎn)采用2×2析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)的方差分析,多重比較采用LSD。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1、光鏡下觀察：CD11c主要表達(dá)于細(xì)胞膜表面,CD11c+細(xì)胞(DCs)主要分布于脾臟邊緣區(qū)、脾索和淋巴濾泡處,體積較大,細(xì)胞核不規(guī)則。2、免疫組化法檢測脾臟中CD11c+細(xì)胞數(shù)在各個(gè)治療組和不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化情況：①同一治療組脾臟DCs數(shù)量隨時(shí)間的變化：模型對照組：與治療前相比較,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)DCs數(shù)量無明顯變化,各時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.107,P=0.955)；單純GM-CSF注射組：與治療前相比較,治療后7天及14天DCs數(shù)量顯著高于治療前,但隨著時(shí)間延長,DCs數(shù)量逐漸下降,至治療后21天,已降至治療前水平,各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.358,P0.001)；單純氬氦冷凍組：與治療前相比較,治療后脾臟DCs數(shù)量顯著高于治療前,隨著時(shí)間延長,DCs數(shù)量逐漸下降,至治療后21天,仍較治療前增多,各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=97.705,P0.001)；氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組：與治療前相比,治療后脾臟DCs數(shù)量顯著高于治療前,隨著時(shí)間延長,DCs數(shù)量雖逐漸下降,但至治療后21天仍顯著高于治療前,各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=417.947,P0.001)；各時(shí)間點(diǎn)脾臟DCs數(shù)量變化總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=338.725,P0.001)。②各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同治療方案對脾臟DCs數(shù)量的影響：治療前,各組脾臟DCs數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(F=0.525,P=0.667)；治療后7天,各治療組脾臟DCs數(shù)量均較對照組升高,尤以氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組最高,各組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=352.023,P0.001)；治療后14天,各治療組脾臟DCs數(shù)量均較對照組升高,尤以氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組最高,各組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=371.914,P0.001)；治療后21天,脾臟DCs數(shù)量：氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組單純氬氦冷凍組及單純GM-CSF注射組,各組之間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.281,P=0.000)；各組脾臟DCs數(shù)量變化總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=464.437,P0.001),各治療組和各時(shí)間點(diǎn)之間有交互效應(yīng),(F=89.925,P0.001)；總結(jié)：單純GM-CSF注射治療和單純氬氦冷凍治療均可增加脾臟組織內(nèi)DCs數(shù)量,但氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療對脾臟DCs數(shù)量的增加更明顯,從時(shí)間變化趨勢上看,聯(lián)合治療組DCs數(shù)量增加更明顯,持續(xù)時(shí)間更長。3、流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟單位體積內(nèi)DCs活化(CD11c+MHCⅡ+、 CD11c+CD86+)在各治療組和不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化情況：①各個(gè)治療組小鼠脾臟DCs活化數(shù)量隨時(shí)間變化情況：模型對照組：各時(shí)間點(diǎn),流式檢測CD11C+MHCⅡ+細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.990,P=-0.422)；流式檢測CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)量差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.602,P=0.228),證實(shí)模型對照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脾臟活化DCs數(shù)量無明顯差異；單純GM-CSF注射組：與治療前相比較,治療后脾臟活化DCs數(shù)量減少；各時(shí)間點(diǎn),流式檢測CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞數(shù)量差異差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=90.296,P0.001);流式檢測CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.357,P0.001),證實(shí)單純GM-CSF注射無法活化小鼠脾臟DCs；單純氬氦冷凍組：與治療前相比較,治療后7天脾臟活化DCs數(shù)量明顯增多,但隨時(shí)間延長逐漸下降,至治療后14天,回復(fù)到治療前水平,而CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)量在治療后21天甚至低于治療前；各時(shí)間點(diǎn),流式檢測CD11C+MHCⅡ+細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.911,P=0.003)；流式檢測CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.759,P=0.003),證實(shí)氬氦冷凍治療能夠活化小鼠脾臟DCs,該作用在治療后7天達(dá)到最高水平,隨時(shí)間延長,氬氦冷凍對小鼠脾臟DCs細(xì)胞的活化作用逐漸減弱,到21天已接近正常或稍低于正常；氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組：與治療前相比較,治療后7天脾臟活化DCs數(shù)量明顯增多,雖隨時(shí)間延長逐漸下降,但直至治療后21天,仍顯著多于治療前。各時(shí)間點(diǎn),流式檢測CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.842,P0.001)；流式檢測CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=123.759,P0.001),證實(shí)聯(lián)合治療能夠明顯活化小鼠脾臟DCs,該作用在治療后7天達(dá)到最高水平,隨時(shí)間延長,氬氦冷凍對小鼠脾臟DCs細(xì)胞的活化作用逐漸減弱,但直至21天仍明顯高于正常水平。②各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脾臟DCs活化數(shù)量組間比較：治療前,流式檢測CD11C+MHCⅡ+細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.037,P=0.990)；流式檢測CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)量差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.661,P=0.249),證實(shí)治療前各組之間小鼠脾臟DCs活化數(shù)量無差異。治療后7天,脾臟活化DCs數(shù)量,氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組單純氬氦冷凍組較模型對照組單純GM-CSF注射組,流式檢測CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞數(shù)量,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=210.835,P0.001)；流式檢測CD11C+CD86+細(xì)胞數(shù)量,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=335.721,P0.001)；治療后14天,脾臟活化DCs數(shù)量,氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組單純氬氦冷凍組模型對照組單純GM-CSF注射組,流式檢測CD11C+MHCⅡ+細(xì)胞數(shù)量,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=92.664,P0.001)；流式檢測CD11C+CD86+細(xì)胞數(shù)量,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=498.586,P0.001)；治療后21天,脾臟活化DCs數(shù)量,流式檢測CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞數(shù)量,,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=120.264,P0.001)；流式檢測CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)量,氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組模型對照組單純氬氦冷凍組單純GM-CSF注射組,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=498.586,P0.001);總結(jié)：單純GM-CSF注射治療并不能增加脾臟組織活化DCs數(shù)量,單純氬氦冷凍組脾臟DC細(xì)胞活化數(shù)量雖有所增加,但隨時(shí)間延長迅速下降,而氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療能顯著增加脾臟組織內(nèi)活化DCs數(shù)量,且持續(xù)時(shí)間長。說明GM-CSF的免疫增強(qiáng)作用在有氬氦冷凍釋放的抗原基礎(chǔ)上起協(xié)同作用,大大提高了DCs的活化效率。4、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各治療組在治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)脾臟細(xì)胞IFN-γ的分泌水平：①各個(gè)治療組脾臟IFN-γ分泌情況時(shí)間變化特征：模型對照組：各時(shí)間點(diǎn)脾臟組織IFN-γ分泌水平之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.209,P=0.338)；單純GM-CSF注射組：治療前、后各時(shí)間點(diǎn)脾臟組織IFN-γ分泌水平之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.188,P=0.903)；單純氬氦冷凍組：與治療前相比較,治療后7天脾臟組織IFN-γ分泌量明顯增多,隨時(shí)間延長逐漸下降,至治療后21天,仍多于治療前,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IFN-γ分泌水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.778,P0.001)；氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組：與治療前相比較,治療后7天脾臟組織IFN-γ分泌量明顯增多,隨時(shí)間延長逐漸下降,但至治療后21天,仍顯著多于治療前,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IFN-γ分泌水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.085,P0.001)。②各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脾臟IFN-γ分泌情況組間比較：治療前,各組脾臟組織IFN-γ分泌水平之間比較,各組之間差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.543,P=0.660)；治療后7天,脾臟組織IFN-γ分泌量,各組之間總體比較,各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.592,P0.001)；氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組單純氬氦冷凍組模型對照組及單純GM-CSF注射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型對照組和單純GM-CSF注射組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.990)；治療后14天,脾臟組織IFN-γ分泌量,各組之間總體比較,各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.221,P0.001)；聯(lián)合治療組、單純氬氦冷凍組和模型組之間差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),結(jié)合表2-4可知：氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組單純氬氦冷凍組模型對照組及單純GM-CSF注射組,而模型對照組和單純GM-CSF注射組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.999)；治療后21天,各組間總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.570,P0.001),聯(lián)合治療組、單純氬氦冷凍組和模型組之間差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),結(jié)合表2-4可知：氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組單純氬氦冷凍組模型對照組及單純GM-CSF注射組,而單純GM-CSF注射組與模型對照組之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)�？偨Y(jié)：單純GM-CSF治療并不能增加脾臟組織IFN-γ分泌量,單純氬氦冷凍雖能一定程度上增加脾臟IFN-γ分泌量,但升高效果并不十分顯著,.而二者聯(lián)合治療能顯著增加脾臟IFN-γ分泌量,且能在較長時(shí)間內(nèi)維持高分泌量。5、LDH實(shí)驗(yàn)檢測治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)脾臟細(xì)胞CTLs殺傷活性：①各個(gè)治療組脾臟CD8+CTLs的殺傷活性時(shí)間變化特征：模型對照組：各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.416,P=0.744)；單純GM-CSF注射組：治療前、后各個(gè)時(shí)間點(diǎn),。脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.644,P=0.219)；單純氬氦冷凍組：治療前、后各個(gè)時(shí)間點(diǎn),脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=110.762,P0.001)；與治療前相比較,治療后7天脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性明顯增強(qiáng),隨時(shí)間延長逐漸下降,至治療后21天,仍高于治療前(各組P0.05)；氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組：治療前、后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)。脾臟組織CD8+ CTLs的殺傷活性各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=208.568,P0.001)；與治療前相比較,治療后7天脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性明顯增強(qiáng),雖然隨時(shí)間延長逐漸下降,但至治療后21天時(shí)仍顯著高于治療前(各組P0.05)。②各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脾臟CD8+CTLs的殺傷活性組間比較：治療前,各組脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.161,P=0.355)；治療后7天,各組之間總體比較,各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=339.756,P0.001)；脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性,多重比較采用LSD法,氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組單純氬氦冷凍組模型對照組單純GM-CSF注射組,聯(lián)合治療組、單純冷凍組和模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),而單純GM-CSF注射組與模型對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；治療后14天及21天,氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組和單純氬氦冷凍組脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性雖有所下降,但仍較模型對照組增強(qiáng)(P0.05),且聯(lián)合治療組明顯高于單純冷凍組(P0.05),而單純GM-CSF注射組與模型對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�？偨Y(jié)：單純GM-CSF注射治療并不能增加脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性,單純氬氦冷凍治療能一定程度上增強(qiáng)脾臟CD8+CTLs的殺傷活性,而氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療后脾臟CD8+CTLs的殺傷活性明顯增加,且持續(xù)時(shí)間較長。結(jié)論采用免疫組化技術(shù)、流式細(xì)胞檢測、ELISA實(shí)驗(yàn)和LDH實(shí)驗(yàn)等多種方法檢測小鼠脾臟DCs的免疫功能變化,結(jié)果表明氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF注射治療能夠增加DCs數(shù)量,增強(qiáng)脾臟DCs的活化,在體內(nèi)促進(jìn)DCs免疫功能活化,進(jìn)而遞呈膠質(zhì)瘤抗原至T淋巴細(xì)胞,從而激活初始型T細(xì)胞,誘導(dǎo)出Thl型免疫應(yīng)答,以及產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞特異性CTL殺傷作用,其中GM-CSF對氬氦冷凍起到了協(xié)同和促進(jìn)作用。本研究利用氬氦冷凍釋放的腫瘤抗原,聯(lián)合免疫增強(qiáng)劑GM-CSF注射,誘導(dǎo)出機(jī)體抗膠質(zhì)瘤特異性的免疫反應(yīng),將膠質(zhì)瘤的局部冷凍治療與全身的抗腫瘤免疫反應(yīng)結(jié)合了起來,為氬氦冷凍治療的臨床應(yīng)用提供了一個(gè)理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41
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本文編號：2390858