【摘要】：為應(yīng)對缺氧和低營養(yǎng)條件的腫瘤微環(huán)境,腫瘤細(xì)胞往往發(fā)生能量代謝的改變,即“代謝重編程”。主要表現(xiàn)在兩個方面:有氧糖酵解和對谷氨酰胺的高度依賴。腫瘤細(xì)胞通過代謝重塑為其生物合成提供大量的中間代謝產(chǎn)物,表明代謝重編程在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中舉足輕重的作用。腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝途徑均受到復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控,因此探討這兩種代謝途徑間的調(diào)控關(guān)系及其產(chǎn)生原因,將為以腫瘤代謝為靶點的腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。近年來,隨著人們對腫瘤細(xì)胞能量代謝重塑的深入研究,發(fā)現(xiàn)M2型丙酮酸激酶(M2 type pyruvate kinase,PKM2)在糖酵解過程中扮演著關(guān)鍵角色。PKM2是糖酵解途徑中將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)化成為丙酮酸和ATP的限速酶。已知PKM2在腫瘤細(xì)胞中特異性高表達,在協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞葡萄糖相關(guān)代謝途徑(包括糖酵解、磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但PKM2是否參與谷氨酰胺代謝及線粒體功能調(diào)控卻鮮為人知。本研究探討了PKM2與谷氨酰胺代謝及線粒體功能調(diào)控之間的關(guān)系,并對其分子機制進行深入研究,為以代謝為靶點的腫瘤治療提供新思路;進一步以PKM2作為腫瘤治療的靶點,探討了白藜蘆醇對PKM2的干預(yù)作用及分子機制,同時拓展了白藜蘆醇的藥用價值。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:(1)探討PKM2與谷氨酰胺代謝之間的關(guān)系及其分子機制。研究結(jié)果表明,PKM2穩(wěn)定敲低能夠增加谷氨酰胺酶Gls1、Gls2,谷氨酰胺轉(zhuǎn)運受體SLC1A5及其上游轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、c-Myc的表達,而PKM2過表達可抑制其表達,表明β-catenin/c-Myc信號通路介導(dǎo)PKM2對谷氨酰胺代謝的調(diào)控。放線菌素D實驗顯示,PKM2上調(diào)β-catenin的表達主要是通過調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平,而不是通過抑制mRNA降解。檢測PKM2不同點突變細(xì)胞株中β-catenin的表達,發(fā)現(xiàn)R399E突變細(xì)胞能明顯抑制β-catenin的表達,即二聚體形式的PKM2發(fā)揮關(guān)鍵作用。PKM2過表達上調(diào)miR-200a的表達,miR-200a可與β-catenin的3’UTR結(jié)合抑制β-catenin的表達。(2)探討PKM2與線粒體功能之間的關(guān)系。采用線粒體探針標(biāo)記PKM2過表達及敲低的細(xì)胞中的線粒體,顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PKM2過表達的細(xì)胞中線粒體圍繞細(xì)胞核分布,融合線粒體的比例升高,線粒體數(shù)量減少。而PKM2敲低后,線粒體分裂為更小的單位,數(shù)量增多。qPCR和western blot結(jié)果顯示PKM2過表達后,線粒體分裂蛋白Drp1表達減少,融合蛋白Mfn2表達升高;PKM2敲低后,Drp1表達升高,Mfn2表達降低;同時,PKM2過表達導(dǎo)致ATP生成量減少,線粒體DNA拷貝數(shù)增加,電子傳遞鏈復(fù)合物的表達下降。(3)探討PKM2通過Drp1調(diào)控線粒體動態(tài)平衡的分子機制。研究結(jié)果顯示PKM2過表達能夠在蛋白水平抑制p53表達,PKM2敲低促進其表達,而對p53mRNA水平?jīng)]有影響。采用p53 siRNA處理細(xì)胞后,Drp1隨p53表達的下降而下降,表明PKM2能夠通過p53調(diào)控Drp1的表達。蛋白穩(wěn)定性實驗提示,PKM2過表達促進了p53通過蛋白酶體途徑降解,而PKM2敲低可增加p53蛋白的穩(wěn)定性,該過程是通過MDM2介導(dǎo)的p53泛素化實現(xiàn)的。免疫共沉淀及GST pull-down實驗表明,PKM2與p53、MDM2存在相互作用,推測PKM2與MDM2可結(jié)合到p53不同的結(jié)構(gòu)域形成三元復(fù)合物促進p53的泛素化,進而通過蛋白酶體途徑被降解。免疫組化檢測宮頸癌病人臨床樣本中PKM2和Drp1的表達,結(jié)果顯示PKM2與Drp1的表達呈負(fù)相關(guān),這與細(xì)胞水平得到的結(jié)果是一致的。(4)探討PKM2通過Mfn2調(diào)控線粒體動態(tài)平衡的分子機制。研究表明PKM2過表達能夠抑制miR-106b的表達。雙熒光素酶報告實驗顯示miR-106b可以直接靶向Mfn2 3’UTR,進而抑制Mfn2的表達。采用miR-106b模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)Mfn2的表達水平顯著降低,融合線粒體的數(shù)量及mtDNA拷貝數(shù)減少,ATP生成量升高。免疫組化檢測乳腺癌病人臨床樣本中PKM2和Mfn2的表達,結(jié)果顯示PKM2與Mfn2的表達呈正相關(guān),這與細(xì)胞中所得結(jié)果是一致的。(5)探討白藜蘆醇對PKM2的干預(yù)作用及分子機制。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過靶向抑制PKM2的表達發(fā)揮其抗腫瘤活性。白藜蘆醇處理后導(dǎo)致線粒體分裂成更小、更多的線粒體,且Drp1和Fis表達明顯升高,Mfn2的表達顯著下降,PKM2過表達可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象;另外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵分子GRP78、CHOP和Caspase12顯著上升,PKM2過表達后其表達明顯逆轉(zhuǎn)。檢測PKM2敲低的穩(wěn)定細(xì)胞株中上述指標(biāo)的表達,發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)及線粒體分裂蛋白表達上調(diào),線粒體融合蛋白表達下降。以上結(jié)果表明PKM2介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體分裂參與白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。雙熒光素酶報告實驗顯示miR-326可直接與PKM2的3’UTR結(jié)合,進一步實驗結(jié)果表明白藜蘆醇能夠通過上調(diào)miR-326有效抑制PKM2的表達。綜上所述:PKM2缺失可通過激活β-catenin/c-Myc信號通路促使谷氨酰胺代謝發(fā)揮代償作用。PKM2一方面通過p53/Drp1軸抑制線粒體分裂,另一方面通過miR-106b/Mfn2軸促進線粒體融合,最終引起線粒體過度融合、功能受阻。白藜蘆醇可通過上調(diào)miR-326干預(yù)PKM2的表達,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體分裂,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。鑒于PKM2在腫瘤代謝及腫瘤生長中的重要作用,PKM2有望作為一個有效的腫瘤治療靶點,同時發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對體內(nèi)PKM2的表達有明顯的抑制作用,拓展了白藜蘆醇的藥用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

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本文編號：2385464