【摘要】：[目的]借助全新膀胱癌特異性單克隆抗體BCMabl、生物素-親和素系統(tǒng)及微流控芯片技術(shù),設(shè)計(jì)并制作膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性篩選芯片,實(shí)現(xiàn)對(duì)膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲,并探討影響芯片捕獲靶細(xì)胞的因素。[方法]1.篩選芯片的設(shè)計(jì):借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)篩選芯片。整個(gè)篩選芯片由上下兩部分組成,且每部分均有微結(jié)構(gòu),上部分為魚骨結(jié)構(gòu),用于改變流體性狀,下部分為微通道結(jié)構(gòu),用于捕獲靶細(xì)胞。2.篩選芯片的制作:制作硅片模板、用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作基片、修剪、打孔、清洗處理,等離子處理鍵合封接上下兩部分,制成篩選芯片。3.篩選芯片的表面修飾:首先,將鏈霉親和素包被到微通道內(nèi);其次,對(duì)膀胱癌單克隆抗體BCMabl進(jìn)行生物素化修飾;最后,將生物素化的抗體灌入微通道內(nèi),鏈霉親和素與生物素化抗體結(jié)合,最終形成鏈霉親和素-生物素-抗體系統(tǒng)。4.樣本液的制備:取膀胱癌細(xì)胞T24作為靶細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)前用熒光染料5(6)-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)按說明對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。取得實(shí)驗(yàn)參與者知情同意,取健康人外周血,用生理鹽水稀釋10倍。將標(biāo)記的膀胱癌細(xì)胞T24加入到稀釋10倍的人外周血液中,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要制備不同細(xì)胞濃度的樣本液。5.芯片的設(shè)計(jì)分組:在實(shí)驗(yàn)中,為了研究抗體對(duì)靶細(xì)胞是否具有捕獲作用,根據(jù)芯片表面抗體包被情況,將芯片制作成兩種:有魚骨結(jié)構(gòu)及BCMabl抗體的芯片;有魚骨結(jié)構(gòu)無BCMabl抗體的芯片。6.芯片捕獲靶細(xì)胞:將60 μ 1、靶細(xì)胞濃度為5 000個(gè)/ml的樣本液以流速為10μl/mmin分別泵入到有魚骨結(jié)構(gòu)及BCMabl抗體的芯片和有魚骨結(jié)構(gòu)無BCMabl抗體的兩組芯片中,沖洗后,于顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)捕獲率。7.探討影響芯片捕獲靶細(xì)胞的因素:①為了探討流速對(duì)芯片捕獲率的影響,將60 μl、濃度為5 000個(gè)/ml的樣本液分別以流速為10、15、20、25和30μl/min泵入到含有抗體及魚骨結(jié)構(gòu)的芯片中;②為了探討細(xì)胞濃度對(duì)芯片捕獲率的影響,將細(xì)胞濃度為500、5 000和50 000個(gè)/ml的樣本液,以10μl/min的速度泵入到含有抗體及魚骨結(jié)構(gòu)的芯片通道內(nèi)進(jìn)行篩選;③為研究魚骨結(jié)構(gòu)對(duì)芯片捕獲靶細(xì)胞的影響,我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種不同的芯片,即含有魚骨結(jié)構(gòu)和未含有魚骨結(jié)構(gòu)的芯片,二者均包被BCMabl抗體,將60 μ l細(xì)胞濃度為5 000個(gè)/ml的樣本液,借助注射泵,以流速為10 μ l/min分別泵入到有魚骨結(jié)構(gòu)及BCMabl抗體的芯片和無魚骨結(jié)構(gòu)有BCMabl抗體的芯片,沖洗后,于顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)。[結(jié)果]1.制作成特異性篩選膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流控芯片,大小為40mm×5mm×3mm。芯片上下兩層,上層為魚骨樣結(jié)構(gòu),寬50 μm,高45 μm,相鄰兩個(gè)魚骨結(jié)構(gòu)之間的間距為100～300 μ m;下層為微通道,微通道高為50 μ m。2.高倍顯微鏡下觀察到,含有抗體及魚骨結(jié)構(gòu)的芯片對(duì)膀胱癌細(xì)胞T4具有明顯的捕獲作用。包被有BCMabl抗體的芯片對(duì)靶細(xì)胞捕獲平均(20.8 ±6.3)個(gè),未含抗體的芯片對(duì)靶細(xì)胞捕獲為平均(1.2± 1.1)個(gè),二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3.在不同細(xì)胞濃度下,芯片對(duì)靶細(xì)胞的捕獲率維持在89%左右。隨著流速的增加芯片對(duì)靶細(xì)胞的捕獲率下降;當(dāng)流速在10 ul/min時(shí),無論是含有魚骨結(jié)構(gòu)的篩選芯片還是不含魚骨結(jié)構(gòu)的篩選芯片,對(duì)靶細(xì)胞的捕獲率最大。在同一流速下,含有抗體及魚骨結(jié)構(gòu)的芯片捕獲率明顯高于含有抗體而未含有魚骨結(jié)構(gòu)的芯片捕獲率為(P0.05)。[結(jié)論]設(shè)計(jì)的捕獲膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞微流控芯片成本低,操作簡(jiǎn)單,具有高特異性捕獲膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[Abstract]:[Objective] To design and manufacture a specific screening chip for bladder cancer circulating tumor cells by means of the novel human bladder cancer specific monoclonal antibody BABl, the biotin-affinity system and the micro-flow control chip technology, and to realize the specific capture of the bladder cancer circulating tumor cells, and to explore the factors that affect the capture of target cells by the wafer.[Method] 1. The design of the filter chip is to filter the chip with the aid of the computer-aided design software. the whole screening chip consists of an upper part and a lower part, and each part has a microstructure, the upper part is a fishbone structure, is used for changing the fluid property, and the lower part is a micro-channel structure and is used for capturing a target cell. The preparation method of the screening chip comprises the following steps of: manufacturing a silicon wafer template, preparing a substrate by using a polydimethylsiloxane (PDMS), trimming, punching, cleaning and processing, and sealing the plasma processing key to form a screening chip. The method for screening the surface of the chip comprises the following steps of: firstly, coating the streptavidin in the micro-channel; secondly, carrying out the biotinylation modification on the bladder cancer monoclonal antibody 1abl; and finally, injecting the biotinylated antibody into the micro-channel, and the streptavidin is combined with the biotinylated antibody, Finally, a streptavidin-biotin-antibody system is formed. The preparation of the sample solution: the bladder cancer cell T24 was taken as the target cell, and the fluorescent dye 5 (6)-Kentucky diacetate (CFDA-SE) was used to mark the target cell according to the instructions before the experiment. To obtain the informed consent of the experimental participants, the peripheral blood of the healthy person was taken, and the peripheral blood of the healthy person was diluted 10 times with normal saline. The labeled bladder cancer cell T24 was added to the diluted 10-fold human peripheral blood and a sample solution of different cell concentrations was prepared according to the experiment. The design group of the chip: in the experiment, in order to study whether the antibody has a capture effect on the target cell, according to the antibody coating condition of the surface of the chip, the chip is made into two chips with the fishbone structure and the ababl antibody; and the chip with the fishbone structure and the ababl antibody is provided. the chip captures the target cell: the sample liquid with the concentration of 60 & mu; l and the target cell concentration of 5,000/ ml is pumped into two groups of chips with the fishbone structure and the ababl antibody respectively at a flow rate of 10 & mu; l/ mmin, Statistical capture rate. 7. In order to study the effect of the flow rate on the capture rate of the chip, 60. m u.l of sample liquid with a concentration of 5,000/ ml was pumped into the chip containing the antibody and the fishbone structure at a flow rate of 10, 15, 20, 25 and 30 & mu; l/ min, respectively. In order to study the effect of cell concentration on the capture rate of the chip, a sample solution with a cell concentration of 500, 5,000 and 50,000/ ml was pumped into a chip channel containing an antibody and a fishbone structure at a rate of 10. m u.l/ min, and the effect of the fishbone structure on the capture target cells of the chip was studied. we designed two different chips, i. e., a chip containing a fishbone structure and a non-fish-bone structure, both of which were coated with a babl antibody, a sample solution of 60. m u.l of cell concentration of 5,000/ ml, the chip with the fishbone structure and the ababl antibody and the chip with the ababl antibody are respectively pumped into the chip with the fishbone structure and the ababl antibody at a flow rate of 10 & mu; l/ min, and then the chip is observed under the microscope and counted under the microscope.[Results] 1. The micro-flow control chip is prepared to specifically screen the circulating tumor cells of the bladder cancer, and the size of the micro-flow control chip is 40mm-5mm and 3mm. the upper layer and the lower layer of the chip are fishbone-like structures, the width of the upper layer is 50 & mu; m, the height is 45 & mu; m, the spacing between the two adjacent fishbone structures is 100-300 & mu; m, the lower layer is a micro-channel, and the micro-channel is high by 50 & mu; m. Under the high-power microscope, the chip containing the antibody and the fishbone structure has obvious capture effect on the bladder cancer cell T4. The average of the target cells (20.8 to 6.3) and the average (1.2-1.1) of the non-antibody-containing chips on target cells was statistically significant (P <0.05). The capture rate of the target cells was maintained at about 89% at different cell concentrations. As the flow rate increases, the capture rate of the target cells is decreased; when the flow rate is in the range of 10 ul/ min, the capture rate of the target cells is the most, whether the screening chip containing the fishbone structure or the filter chip without the fishbone structure. At the same flow rate, the capture rate of the chip containing the antibody and the fishbone structure was significantly higher than that of the chip containing the antibody without the fishbone structure (P0.05).[Conclusion] The design of the micro-flow control chip for the bladder cancer circulating tumor cell is low in cost, simple in operation, and has high specificity for capturing the circulating tumor cells of the bladder cancer.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：2385048