【摘要】：膽管癌(Cholangiocarcinoma,CC)是指發(fā)生于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,按其發(fā)生部位分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌兩大類。在世界范圍內(nèi),膽管癌占所有胃腸道腫瘤的3%,是繼肝細(xì)胞癌外第二常見的肝膽腫瘤,尸檢資料顯示膽管癌的發(fā)病率約為0.01%~0.2%。近年來膽管癌的發(fā)病率逐年升高,目前手術(shù)治療是膽管癌唯一有效的治療,然而治療效果尚欠佳,預(yù)后很差,只有少數(shù)患者術(shù)后能存活5年以上。膽汁酸在脂肪的攝取和脂溶性維生素的吸收方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用,近年來,膽汁酸作為一種信號分子被許多專家和學(xué)者所關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),膽汁淤積會加速膽管癌的發(fā)生;體外試驗(yàn)證明,結(jié)合膽汁酸促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的侵襲行為。膽汁酸作為配體,能夠活化多種受體,包括核受體和膜受體,其中TGR5是一種以膽汁酸為配體的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。TGR5在多種組織和器官中有不同水平的表達(dá),功能多樣。TGR5可以調(diào)節(jié)能量代謝,促進(jìn)胰島素的分泌和生物合成,促進(jìn)B細(xì)胞增殖,抑制凋亡,減輕食欲,減緩胃排空;抑制炎癥反應(yīng)和炎癥因子的釋放,在肝臟中減輕肝臟損傷,延緩脂肪變,促進(jìn)竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)凋亡,提高肝臟本身的代謝和微循環(huán)等等。值得關(guān)注的是,TGR5能夠促進(jìn)正常膽管上皮細(xì)胞增殖,抑制其凋亡。TGR5也可以通過激活各種信號通路在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。研究表明,TGR5促進(jìn)食管癌,結(jié)腸癌和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,而在肝癌和胃癌中,則通過抑制STAT3通路抑制其發(fā)生與發(fā)展,并與胃癌患者預(yù)后相關(guān)。但目前,TGR5在膽管癌中的作用及其機(jī)制研究很少。熱休克蛋白(HSP)是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下合成并表達(dá)的高度保守的分子伴侶蛋白,按照其分子量大小分為HSP27,HSP40,HSP60,HSP70和HSP90五個(gè)家族。HSP參與多種重要的生理過程,包括蛋白組裝,分泌,運(yùn)輸,以及蛋白降解和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)等等。Mortalin蛋白屬于hsp70家族成員,又名csa,mot,grp75,pbp74,hspa9b,mgc4500,mthsp75等,最早由wadhwa等人在小鼠成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。研究表明,mortalin作為一種多功能分子伴侶,介導(dǎo)調(diào)控了諸多生理及病理過程,如細(xì)胞增殖,細(xì)胞器蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài),凋亡,蛋白的囊泡運(yùn)輸以及神經(jīng)退行性變等。鑒于膽汁淤積能夠加速膽管癌的發(fā)生,膽汁酸受體tgr5有促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞增殖,抑制其凋亡的作用,且課題組之前實(shí)驗(yàn)證實(shí),在小腸上皮細(xì)胞中,tgr5與hsp70家族蛋白mortalin相互結(jié)合并發(fā)揮作用,我們提出假設(shè):tgr5在膽管癌組織中高表達(dá);tgr5與mortalin相互作用參與膽管癌的發(fā)生與發(fā)展。并設(shè)計(jì)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):1比較分析tgr5在肝外膽管癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況,探討其及與患者臨床特征的關(guān)系;2觀察tgr5對膽管癌細(xì)胞增殖,遷移,凋亡等生物學(xué)行為的影響;3通過分析tgr5與hsp家族蛋白mortalin的相互作用進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。結(jié)果表明,tgr5在肝外膽管癌組織中表達(dá)升高,其表達(dá)水平與肝外膽管癌病理學(xué)惡性程度呈正相關(guān);tgr5促進(jìn)人膽管癌細(xì)胞的增殖與遷移,抑制其凋亡;hsp家族蛋白mortalin參與了tgr5誘導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞增殖。第一部分:tgr5在肝外膽管癌組織中的表達(dá)分析及臨床意義探討目的:對比tgr5在肝外膽管癌患者和癌旁組織的表達(dá)情況并探討其及與肝外膽管癌患者性別,年齡,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否,病理學(xué)分級以及臨床分期的關(guān)系。方法:收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科2000-2002年膽管癌術(shù)后石蠟包埋標(biāo)本87例,其中有相應(yīng)癌旁對照組織20例。于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病案室查閱患者臨床資料,包括性別,年齡,腫瘤大小,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,病理學(xué)分級與臨床分期。病理證實(shí)所取標(biāo)本均為肝外膽管癌組織,應(yīng)用免疫組織化學(xué)(ihc)的方法檢測tgr5的表達(dá)水平,并且比較分析20例肝外膽管癌及癌旁組織tgr5的表達(dá)情況。檢測tgr5的表達(dá)水平與肝外膽管癌患者性別,年齡,腫瘤大小,是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,病理學(xué)分級與臨床分期等臨床數(shù)據(jù)的關(guān)系。結(jié)果:1肝外膽管癌患者的臨床病理特征歸納詳細(xì)記錄患者臨床資料,在87例肝外膽管癌患者中,男性50例(57.5%),女性37例(42.5%);平均年齡58歲,低于等于58歲患者46例(52.9%),高于58歲患者41例(47.1%);高中分化組織63例(72.4%),低分化組織24例(27.6%);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例(25.3%),無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例(62.1%),不能確定有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例(12.6%);tnm分期i期15例(17.2%),ii期21例(24.1%),iii期27例(31%),iv期14例(16.1%);其中有相應(yīng)癌旁對照組織20例。2肝外膽管癌組織中tgr5表達(dá)水平高于癌旁組織所有納入膽管癌組織經(jīng)he染色證實(shí)為膽管癌。為初步判斷tgr5是否在膽管癌中發(fā)揮作用,本課題用免疫組化的方法,對比了20例肝外膽管癌組織和癌旁組織tgr5的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,tgr5主要表達(dá)于肝外膽管癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞漿;肝外膽管癌組織中tgr5的總體表達(dá)水平顯著高于癌旁組織tgr5的總體表達(dá)水平,說明tgr5在膽管癌組織中高表達(dá)。3tgr5的表達(dá)水平與肝外膽管癌病理學(xué)惡性程度呈正相關(guān)為進(jìn)一步觀察tgr5的臨床意義,本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)(ihc)方法檢測了87例肝外膽管癌中tgr5的表達(dá)情況,并按照tgr5在膽管癌腺體中的表達(dá)強(qiáng)度將所納入標(biāo)本分為1+,2+,3+,4+共4個(gè)等級。查閱患者的臨床資料,包括年齡,性別,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否,病理分級與臨床分期,并分析tgr5表達(dá)強(qiáng)度與臨床資料的關(guān)系。結(jié)果顯示,tgr5的表達(dá)水平與患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期無明顯相關(guān)性。而與肝外膽管癌病理學(xué)惡性程度呈正相關(guān),提示其表達(dá)水平對膽管癌患者的惡性程度有一定的提示作用。第二部分:tgr5對膽管癌細(xì)胞增殖,遷移,凋亡等生物學(xué)行為的影響目的:通過建立tgr5過表達(dá)和敲低細(xì)胞模型,探討tgr5對膽管癌細(xì)胞增殖,遷移,凋亡等生物學(xué)行為的影響。方法:在人膽管癌細(xì)胞系rbe和qbc-939中過表達(dá)或者敲低tgr5,通過cck-8試驗(yàn)檢測細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化,westernblot檢測增殖標(biāo)志pcna以及細(xì)胞周期蛋白cdc25c和cyclind1表達(dá),brdu摻入實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞dna合成情況綜合評估細(xì)胞增殖行為變化;創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移行為;annexinv/pi雙染染色檢測細(xì)胞凋亡比例,westernblot檢測活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)表達(dá)評估細(xì)胞凋亡行為。結(jié)果:1tgr5敲低及過表達(dá)膽管癌細(xì)胞模型建立應(yīng)用靶向tgr5的sirna(sitgr5)分別轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞系rbe和qbc-939,并轉(zhuǎn)染無關(guān)對照序列(sicon)作為對照,westernblot檢測結(jié)果顯示,和sicon組比較,sitgr5組tgr5蛋白表達(dá)水平明顯下降,表明tgr5在兩種細(xì)胞中的表達(dá)均被成功敲低。應(yīng)用帶flag標(biāo)簽的tgr5過表達(dá)質(zhì)粒(flag-tgr5)分別轉(zhuǎn)染rbe和qbc-939細(xì)胞,并以僅帶flag標(biāo)簽的空載體(flag-con)作為對照,westernblot結(jié)果顯示,和flag-con組比較,兩種細(xì)胞flag-tgr5組tgr5表達(dá)水平明顯上升,表明該質(zhì)粒在兩種細(xì)胞中均可成功過表達(dá)tgr5。2tgr5促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖2.1tgr5促進(jìn)膽管癌細(xì)胞中pcna表達(dá)westernblot分析結(jié)果顯示,sitgr5轉(zhuǎn)染細(xì)胞72h后,兩種細(xì)胞系中sitgr5組pcna相對表達(dá)水平明顯低于sicon組。轉(zhuǎn)染tgr5過表達(dá)質(zhì)粒72h后,兩種細(xì)胞系中flag-tgr5組pcna相對表達(dá)水平明顯高于flag-con組。表明在膽管癌細(xì)胞系中,tgr5的表達(dá)水平與pcna呈正相關(guān)。2.2tgr5表達(dá)水平與膽管癌細(xì)胞活力呈正相關(guān)cck-8試驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染72h后兩種細(xì)胞系中sitgr5組od450值較sicon組明顯降低。flag-tgr5組細(xì)胞活力則較flag-con組明顯升高。表明在兩種膽管癌細(xì)胞系中,tgr5的表達(dá)水平與細(xì)胞活力呈正相關(guān)。2.3過表達(dá)tgr5促進(jìn)膽管癌細(xì)胞有絲分裂通過流式細(xì)胞術(shù)檢測tgr5對膽管癌細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示在rbe細(xì)胞中,與flag-con組相比,flag-tgr5組s期細(xì)胞所占比例上升,g2期細(xì)胞所占比例減少,g1期細(xì)胞比例無明顯變化,表明tgr5可以促進(jìn)rbe細(xì)胞有絲分裂。在qbc-939細(xì)胞中,與flag-con組相比,flag-tgr5組s期細(xì)胞所占比例上升,g1期細(xì)胞所占比例減少,g2期細(xì)胞所占比例減少,表明tgr5可以促進(jìn)qbc-939細(xì)胞有絲分裂。2.4過表達(dá)tgr5促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)westernblot分析結(jié)果顯示,在qbc-939細(xì)胞系中,與flag-con組相比,flag-tgr5組細(xì)胞周期蛋白cdc25c及cyclind1表達(dá)顯著升高。在rbe細(xì)胞中,與flag-con組相比,flag-tgr5組cdc25c蛋白表達(dá)升高,而cyclind1表達(dá)無明顯變化,上述結(jié)果表明tgr5可能通過上調(diào)促分裂周期蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。2.5過表達(dá)tgr5促進(jìn)膽管癌細(xì)胞dna合成brdu摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在兩種膽管癌細(xì)胞系中,flag-tgr5組較flag-con組dna合成均明顯增多。提示過表達(dá)tgr5能夠促進(jìn)膽管癌細(xì)胞dna合成。以上結(jié)果綜合提示tgr5可以促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖。3tgr5抑制膽管癌細(xì)胞凋亡在tgr5被成功敲低以及過表達(dá)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用annexinv/pi雙染染色檢測細(xì)胞凋亡比例,westernblot檢測活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleavedcaspase-3)表達(dá)評估細(xì)胞凋亡行為。westernblot分析結(jié)果顯示,兩種膽管癌細(xì)胞系中sitgr5組細(xì)胞較sicon組cleavedcaspase-3表達(dá)水平明顯增加,flag-tgr5組較flag-con組cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)水平降低,提示tgr5表達(dá)水平與膽管癌細(xì)胞cleavedcaspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。annexinv/pi雙染染色結(jié)果顯示,兩種膽管癌細(xì)胞系中sitgr5組細(xì)胞凋亡率較sicon組明顯增加。上述結(jié)果綜合提示tgr5可以抑制膽管癌細(xì)胞的凋亡。4tgr5促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞rbe遷移在成功敲低以及過表達(dá)tgr5的基礎(chǔ)上,應(yīng)用創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞遷移行為。結(jié)果顯示,在rbe細(xì)胞系中,sitgr5組細(xì)胞較sicon組劃痕愈合明顯減慢,flag-tgr5組較flag-con組劃痕愈合速度加快。但qbc-939細(xì)胞系本身遷移性能較差,無論實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞均未見明顯創(chuàng)傷愈合。以上結(jié)果提示tgr5可能促進(jìn)膽管癌細(xì)胞系遷移。第三部分:tgr5通過結(jié)合并上調(diào)mortalin促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖目的:通過研究tgr5與mortalin的相互作用,探討tgr5促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。方法:在兩種膽管癌細(xì)胞系中敲低tgr5,從蛋白水平以及mrna水平檢測mortalin的表達(dá):將細(xì)胞分為以下4組,對照組(flag-con+sicon);tgr5過表達(dá)組(flag-tgr5+sicon);mortalin敲低組(flag-con+simortalin),tgr5過表達(dá)同時(shí)mortalin敲低組(flag-tgr5+simortalin)。通過cck-8試驗(yàn)檢測細(xì)胞活力,克隆形成試驗(yàn)檢測克隆形成率,westernblot檢測pcna表達(dá),以確定mortalin是否參與tgr5誘導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞增殖;并通過免疫共沉淀及免疫細(xì)胞熒光雙染檢測tgr5和mortalin的結(jié)合情況。結(jié)果:1tgr5促進(jìn)mortalin蛋白及mrna的表達(dá)在兩種膽管癌細(xì)胞系中敲低tgr5,應(yīng)用westernblot分析和pcr的方法檢測mortalin在mrna水平和蛋白水平的表達(dá)。westernblot結(jié)果表明,sitgr5組較敲sicon組mortalin明顯減少,表明敲低tgr5降低了mortalin的蛋白水平。但敲低mortalin并不影響tgr5表達(dá)水平。pcr結(jié)果顯示,與sicon組相比,sitgr5組的mortalinmrna表達(dá)下降,表明敲低tgr5下調(diào)了mortalin的mrna水平。2tgr5通過mortalin誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞增殖2.1敲低mortalin抑制tgr5誘導(dǎo)的pcna表達(dá)增加westernblot分析結(jié)果顯示,利用靶向mortalin的sirna轉(zhuǎn)染兩種膽管癌細(xì)胞,可在在兩種膽管癌細(xì)胞中成功敲低mortalin蛋白,且較flag-con+sicon組相比,flag-tgr5+sicon組的pcna表達(dá)明顯升高,即上調(diào)tgr5可促進(jìn)細(xì)胞增殖,與第二部分結(jié)果相一致。而flag-tgr5+simortalin組的pcna表達(dá)則顯著低于flag-tgr5+sicon組,表明敲低mortalin抑制了tgr5誘導(dǎo)的pcna表達(dá)增加。2.2敲低mortalin抑制tgr5誘導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞活力增加cck-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與第二部分結(jié)果一致,在兩種膽管癌細(xì)胞中,較flag-con+sicon組,flag-tgr5+sicon組的細(xì)胞活力明顯升高,提示tgr5可以有效升高膽管癌細(xì)胞活力。而較flag-tgr5+sicon組,flag-tgr5+simortalin組的細(xì)胞活力顯著降低,表明敲低mortalin抑制了tgr5誘導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞活力的增加。2.3敲低mortalin抑制tgr5誘導(dǎo)的克隆形成增加克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在兩種膽管癌細(xì)胞中,較flag-con+sicon組,Flag-TGR5+siCon組的克隆形成數(shù)目明顯增多,表明TGR5上調(diào)可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的克隆成能力;而較Flag-TGR5+siCon組,Flag-TGR5+simortalin組克隆形成數(shù)目減少,表明敲低mortalin抑制了TGR5誘導(dǎo)的克隆形成數(shù)目增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合表明,在膽管癌細(xì)胞中,mortalin參與了TGR5誘導(dǎo)的促增殖作用。3 TGR5與mortalin存在相互結(jié)合。本研究通過免疫共沉淀和免疫細(xì)胞熒光的方法驗(yàn)證TGR5與mortalin是否存在相互結(jié)合。在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中,分別在膽管癌細(xì)胞系RBE和QBC-939中轉(zhuǎn)染帶Flag標(biāo)簽的TGR5質(zhì)粒(Flag-TGR5),并以帶Flag標(biāo)簽的空載體(Flag-Con)作為對照,用抗Flag的抗體進(jìn)行沉淀,并進(jìn)行Western Blot分析,用抗mortalin的抗體進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,mortalin條帶僅特異性出現(xiàn)于Flag-TGR5組,表明TGR5和mortalin存在相互結(jié)合。免疫細(xì)胞熒光染色結(jié)果表明,在膽管癌細(xì)胞系RBE中,紅色熒光標(biāo)記的TGR5彌散分布于細(xì)胞質(zhì),綠色熒光標(biāo)記的mortalin主要定位于核周,核周部分熒光密度較高,兩者熒光部分重疊(黃色區(qū)域),表明TGR5與mortalin存在部分共定位。上述結(jié)果表明,TGR5和mortalin蛋白在膽管癌細(xì)胞中存在相互作用。結(jié)論:1 TGR5在肝外膽管癌組織中表達(dá)升高,其表達(dá)水平與膽管癌組織病理學(xué)惡性程度呈正相關(guān),TGR5可能參與了膽管癌的發(fā)生并對其惡性程度有提示作用。2 TGR5促進(jìn)人膽管癌細(xì)胞的增殖與遷移,抑制其凋亡。3 HSP家族蛋白mortalin參與了TGR5誘導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞增殖。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Caspase Family Proteases and Apoptosis[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年11期

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本文編號：2368949