【摘要】：背景:我國(guó)是原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的高發(fā)國(guó)家,占每年全球新發(fā)肝癌例數(shù)的55%左右,死亡人數(shù)占全球的40%以上,而且肝癌的發(fā)生率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。盡管以手術(shù)切除為核心的肝癌綜合治療體系已經(jīng)形成,但是術(shù)后腫瘤高復(fù)發(fā)率仍是威脅患者長(zhǎng)期生存的主要因素。此外,對(duì)于無(wú)法實(shí)施手術(shù)的腫瘤晚期患者,目前也缺乏理想的治療方案。近年來(lái),隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制的深入研究,以此為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的分子靶向藥物在臨床逐漸得到推廣,這給晚期肝癌患者帶來(lái)希望的同時(shí)也存在藥物療效欠佳、副作用較大等方面的問(wèn)題。因此,探索肝細(xì)胞肝癌新的發(fā)病機(jī)制、尋找新的潛在治療靶點(diǎn)具有極其重要的臨床和科學(xué)意義。目的:本項(xiàng)目前期通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選出在肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織中差異表達(dá)的鉀通道,并通過(guò)PCR和Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證。系統(tǒng)研究篩選出的鉀通道KCa3.1在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)模式及功能,明確鉀通道KCa3.1的表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系,通過(guò)進(jìn)一步的體內(nèi)和體外研究闡明鉀通道KCa3.1在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其細(xì)胞分子機(jī)制,為肝細(xì)胞癌的治療提供新的理論依據(jù)和防治策略。方法:1.收集95對(duì)肝癌臨床標(biāo)本,PCR、Western Blot、免疫組化技術(shù)研究KCa3.1的表達(dá)及定位,并分析其表達(dá)與臨床病理特征、患者預(yù)后的關(guān)系。2.利用慢病毒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定高/低表達(dá)鉀離子通道KCa3.1的人肝癌細(xì)胞株(Huh7、LM3細(xì)胞),觀察KCa3.1的表達(dá)情況對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞功能學(xué)的影響。在兩個(gè)肝癌細(xì)胞株中分別沉默或過(guò)表達(dá)KCa3.1,利用Cell Counting Kit-8(CCK8)、EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期和凋亡水平;集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的集落形成能力;Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。3.將穩(wěn)定高/低表達(dá)鉀離子通道KCa3.1的人肝癌細(xì)胞株(Huh7、LM3)接種至裸鼠皮下,通過(guò)構(gòu)建人肝癌裸鼠皮下移植模型,比較KCa3.1的表達(dá)情況對(duì)裸鼠皮下移植瘤成瘤能力的影響。4.將沉默KCa3.1的Huh7細(xì)胞以及作為陰性對(duì)照Huh7細(xì)胞進(jìn)行人基因表達(dá)譜芯片檢測(cè),將差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類、通路分析、IPA分析;選取芯片結(jié)果中升高降低較明顯的基因,設(shè)計(jì)引物,在Huh7細(xì)胞和LM3細(xì)胞中(沉默或過(guò)表達(dá)KCa3.1)進(jìn)行驗(yàn)證。5.根據(jù)細(xì)胞功能學(xué)結(jié)果及芯片分析結(jié)果,Western Blot檢測(cè)周期相關(guān)通路以及EMT相關(guān)通路。6.根據(jù)芯片分析結(jié)果以及Western Blot結(jié)果,發(fā)現(xiàn)SKP2以及RELN可能是KCa3.1功能發(fā)揮相關(guān)的靶基因,利用SKP2表達(dá)質(zhì)粒及RELN小干擾RNA進(jìn)行補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1.與癌旁組織相比,PCR結(jié)果顯示肝癌組織與癌旁組織之間KCa3.1 mRNA的表達(dá)差異不大;Western Blot結(jié)果顯示KCa3.1在低分化肝癌組織中表達(dá)升高;免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示KCa3.1蛋白主要表達(dá)在胞膜胞漿中,KCa3.1的表達(dá)情況與癌組織的組織學(xué)分級(jí)相關(guān)。2.肝癌細(xì)胞Huh7、LM3沉默KCa3.1之后,細(xì)胞的增殖能力減弱,遷移和侵襲能力減弱,凋亡細(xì)胞增多,細(xì)胞周期阻滯,過(guò)表達(dá)KCa3.1之后,細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),遷移侵襲能力增強(qiáng),凋亡細(xì)胞減少,細(xì)胞周期進(jìn)展。3.肝癌裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)提示Huh7、LM3細(xì)胞沉默KCa3.1之后,裸鼠皮下成瘤能力減弱,過(guò)表達(dá)KCa3.1之后,裸鼠皮下成瘤能力增強(qiáng)。4.基因芯片結(jié)果提示細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路的激活受到KCa3.1表達(dá)情況的影響,此外,KCa3.1沉默或過(guò)表達(dá)后,SKP2、RELN基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化。5.Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)鉀離子通道KCa3.1可以激活細(xì)胞周期相關(guān)的通路以及EMT相關(guān)通路。6.SKP2的補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)證實(shí)KCa3.1可以通過(guò)調(diào)控SKP2/p21、p27信號(hào)通路控制肝癌細(xì)胞周期進(jìn)展,影響肝癌細(xì)胞的增殖能力,RELN的補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)證實(shí)KCa3.1可以通過(guò)RELN調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移侵襲。結(jié)論:鉀通道KCa3.1在低分化肝癌組織中表達(dá)明顯升高;肝癌細(xì)胞沉默KCa3.1后可以減弱肝癌Huh7和LM3細(xì)胞的增殖能力、遷移、侵襲能力以及裸鼠皮下成瘤能力,阻滯細(xì)胞周期以及增加細(xì)胞凋亡水平,過(guò)表達(dá)KCa3.1可以逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng);KCa3.1可以通過(guò)調(diào)控SKP2/p21、p27信號(hào)通路控制肝癌細(xì)胞周期進(jìn)展,影響肝癌細(xì)胞的增殖能力;KCa3.1可以調(diào)控RELN以及EMT信號(hào)通路控制肝癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。以上研究表明KCa3.1在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,是肝癌治療的潛在靶點(diǎn),對(duì)KCa3.1相關(guān)的上下游基因、信號(hào)通路的研究可以為肝癌治療提供更多可供選擇的靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 賈勇圣;魏曉莉;趙杰;鄭建全;;離子通道與腫瘤[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2007年03期

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本文編號(hào)：2368927