【摘要】：胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,其在亞洲的發(fā)病率高于其他幾個洲。在我國胃癌的發(fā)病率和死亡率也都非常高。但是,我國早期胃癌的發(fā)現(xiàn)率約20%,且其常在癌癥晚期或者因轉(zhuǎn)移性胃癌而被發(fā)現(xiàn)。因此,我國多為進展期胃癌,并且預(yù)后比較差,常需要以手術(shù)治療為主,放化療等為輔的綜合治療手段。目前,胃癌的輔助化療、姑息化療的方案很多,其中以鉑類和氟尿嘧啶為一線藥物,如順鉑+氟尿嘧啶,氟尿嘧啶+奧沙利鉑,DCF,ECF等,但其生存時間并不理想。近年來,靶向藥物在胃癌的治療中成為一大熱點。由于胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個具有多因素、多階段和多種基因共同參與的過程,因此其發(fā)病機制并不清楚,目前除了赫賽汀外,多數(shù)藥物在胃癌研究中并未取得突破。所以尋找新的靶基因,闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機制對治療胃癌有重要的作用。成纖維生長因子(FGFRs)是免疫球蛋白基因超家族成員,分布在多種細胞膜上。近年來,關(guān)于FGFR家族分子在不同腫瘤中的報道日益增多,其中以FGFR4多肽性位點Gly388Arg研究最多。部分研究者認為,FGFR家族在惡性腫瘤診治方面有廣闊的應(yīng)用前景。但迄今為止,FGFR4在胃癌中的研究很少。FGFR4在常見的惡性腫瘤如胰腺癌、橫紋肌肉瘤、乳腺癌以及腎細胞癌中均呈高表達。迄今發(fā)現(xiàn)的20多種成纖維生長因子(FGF)中有10個能與FGFR4結(jié)合,其中僅有FGF19與FGFR4特異性結(jié)合。FGFR4激活后能夠使FGF19促進肝細胞增殖,誘導(dǎo)肝癌形成。一些報道顯示PD173074(簡稱PD)與FGFR家族有很好的親和力和選擇性,并且PD能夠抑制肝癌細胞增殖。部分研究證明,PD能夠逆轉(zhuǎn)FGF19特異性的刺激AFP產(chǎn)量增加,從而推測PD能夠抑制FGFR4的活性。由于目前FGFR4在胃癌中的研究比較少,因此本課題著重探討FGFR4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為胃癌的早期診斷以及預(yù)后,基因治療提供強有力的理論依據(jù)。本實驗通過體內(nèi)體外功能學(xué)實驗檢測FGFR4在不同來源胃癌細胞系中的生物學(xué)特性的表達異同,探討成纖維細胞生長因子受體4(FGFR4)在胃癌(GC)的功能,并探討FGFR4針對胃癌治療的價值。通過慢病毒構(gòu)建FGFR4過表達細胞株,用于裸鼠胃癌模型的建立,進行體內(nèi)體外相關(guān)實驗,檢測不同F(xiàn)GFR4表達組的成瘤情況。利用5-Fu和PD173074單藥或聯(lián)合,干預(yù)慢病毒處理的細胞株,進行體外相關(guān)實驗,探討兩藥聯(lián)合后對胃癌生物學(xué)行為的影響和機制,更全面的研究FGFR4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為PD173074應(yīng)用于胃癌臨床治療提供依據(jù),為胃癌的預(yù)后提供新的評價指標。第一部分成纖維生長因子受體4在胃癌中作用的功能研究第一章纖維生長因子受體4在胃癌細胞系中作用的功能研究背景與目的:胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,在我國,早期胃癌的發(fā)現(xiàn)率約20%,常在癌癥晚期或者因轉(zhuǎn)移性胃癌而被發(fā)現(xiàn)。我國多為進展期胃癌,并且預(yù)后比較差,常需要以手術(shù)治療為主,放化療等為輔的綜合治療。目前,胃癌的輔助化療、姑息化療的方案很多,其中以鉑類和氟尿嘧啶為一線藥物,如順鉑+氟尿嘧啶,氟尿嘧啶+奧沙利鉑,DCF,ECF等,但其生存時間并不理想。近年來,靶向藥物在胃癌的治療中成為一大熱點。但除了赫賽汀外,多數(shù)藥物在胃癌研究中并未取得突破。所以尋找新的靶基因,闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機制對治療胃癌有重要的作用。成纖維生長因子(FGFRs)是免疫球蛋白基因超家族成員,分布在多種細胞膜上。近年來,關(guān)于FGFR家族分子在不同腫瘤中的報道日益增多,其中以FGFR4多肽性位點Gly388Arg研究最多。部分研究者認為,FGFR家族在惡性腫瘤診治方面有廣闊的應(yīng)用前景。但迄今為止,FGFR4在胃癌中的研究很少。本研究旨在通過慢病毒載體介導(dǎo),構(gòu)建成FGFR4過表達細胞株,研究FGFR4對胃癌細胞系增殖能力,侵襲能力,凋亡的影響。檢測不同處理組效應(yīng)蛋白表達的變化,探討FGFR4對胃癌細胞生物學(xué)行為影響的機制。方法:利用Real-time PCR檢測FGFR4在胃癌細胞系HGC27,MKN45,MKN28,MGC803,BGC823,SGC7901,293T中的表達情況,篩選出FGFR4低表達細胞株。通過慢病毒構(gòu)建FGFR4過表達細胞株,通過CCK8檢測過表達細胞株和正常細胞株增殖情況的改變。流式細胞分選儀檢測FGFR4對胃癌細胞系凋亡的影響,以及通過Transwell檢測其侵襲能力的改變。Western Blot檢測不同處理組效應(yīng)蛋白表達的變化。結(jié)果:本研究構(gòu)建成功FGFR4過表達細胞株,分別設(shè)正常細胞組,陰性質(zhì)粒組以及FGFR4過表達細胞組。其中FGFR4過表達細胞組較正常組及陰性質(zhì)粒對照組的增值率和侵襲能力均增強,凋亡率降低。PCNA和Bcl-xl的表達增高,凋亡相關(guān)蛋白表達降低。結(jié)論:本研究從不同惡性程度的胃癌細胞株中篩選出兩株FGFR4低表達細胞株,并通過慢病毒轉(zhuǎn)染將其構(gòu)建成FGFR4高表達胃癌細胞株,通過研究其過表達后增殖能力,侵襲能力,凋亡情況以及凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)FGFR4過表達后的胃癌細胞株增殖能力增強,凋亡率減少,侵襲能力增強,提示FGFR4能夠促進胃癌細胞生長,增加其惡性程度,促進胃癌細胞侵襲性。第二章成纖維生長因子受體4在裸鼠成瘤中作用的研究背景與目的:FGFR4在常見的惡性腫瘤如胰腺癌、橫紋肌肉瘤、乳腺癌以及腎細胞癌中均呈高表達。迄今發(fā)現(xiàn)的20多種成纖維生長因子(FGF)中有10個能與FGFR4結(jié)合,其中僅有FGF19與FGFR4特異性結(jié)合。FGFR4激活后能夠使FGF19促進肝細胞增殖,誘導(dǎo)肝癌形成。由于目前FGFR4在胃癌中的研究比較少,因此本課題著重探討FGFR4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為胃癌的早期診斷以及預(yù)后,基因治療提供強有力的理論依據(jù)。方法:將FGFR4過表達細胞株和相應(yīng)未處理的胃癌細胞株皮下注射至裸鼠背部,構(gòu)建裸鼠胃癌模型。接種6-8周后,觀測不同處理組成瘤體積,大小指標的變化。通過TUNEL法檢測不同組的組織中細胞凋亡情況。結(jié)果:皮下注射FGFR4過表達MBGC803和BGC823細胞株的裸鼠瘤體積明顯大于陰性對照組和空白對照組,且此差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。此差異尤其在細胞注射后第10天,13天和16天最為明顯。通過TUNEL法檢測組織中細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)FGFR4高表達組的MGC803和BGC823中凋亡減少。結(jié)論:FGFR4的過表達能夠促進胃癌細胞在體內(nèi)的增長,減少細胞凋亡。故我們推測高表達的FGFR4可能會加速晚期胃癌的進展。第二部分成纖維生長因子受體4抑制劑和5-Fu在胃癌中作用機制的研究背景與目的PD173074(簡稱PD)與FGFR家族有很好的親和力和選擇性,近年來一些學(xué)者認為PD能夠抑制肝癌細胞增殖。盡管不能排除PD可能通過抑制FGFR1、FGFR2或FGFR3而達到抑制細胞增殖的目的,但是PD能夠逆轉(zhuǎn)FGF19特異性的刺激AFP產(chǎn)量增加,提示了PD主要是通過抑制FGFR4而抑制細胞增殖。此外,PD對FGFR4高表達的肝癌細胞株Hu H7d的抗增殖作用顯著強于FGFR4低表達的肝癌細胞株及非癌細胞株,因此進一步說明FGFR4相對于其他FGFRs亞型而言,對PD的效能發(fā)揮起到更重要的作用。FGFR4在胃癌中的研究甚少,因此我們將著重探討FGFR4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法PD173074和5-Fu單藥或兩藥聯(lián)合處理FGFR4過表達細胞株,分別以各自未行處理的細胞株作為對照,進行一系列體外功能試驗,評價PD173074和5-Fu對FGFR4不同表達水平的胃癌細胞株的生物學(xué)行為的影響。同時在分子水平上檢測不同處理因素作用后,細胞增殖,凋亡及細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的變化。結(jié)果:單用5-Fu和PD以及兩藥聯(lián)合后對胃癌細胞株MGC803和BGC823的細胞增殖起到抑制作用,且增加細胞的凋亡率。將這兩株細胞通過轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建FGFR4過表達細胞株后,細胞對5-Fu和PD以及兩藥聯(lián)合的敏感度降低,細胞增殖所受的抑制作用減輕,凋亡率較未過表達的細胞株降低。結(jié)論:單用5-Fu和PD以及兩藥聯(lián)合后對胃癌細胞株MGC803和BGC823的細胞增殖起到抑制作用,且增加細胞的凋亡率。過表達FGFR4能夠減輕5-Fu和PD對胃癌細胞株的增值抑制作用,若想和正常胃癌細胞得到相同的增殖抑制情況必須加大5-Fu和PD的給藥劑量,以獲得滿意的療效。全文結(jié)論:通過轉(zhuǎn)染慢病毒構(gòu)建FGFR4過表達胃癌細胞株,進行體內(nèi)體外功能學(xué)實驗。FGFR4過表達后通過增加腫瘤細胞的侵襲能力和增殖能力來減少腫瘤細胞的凋亡程度,提高腫瘤的惡性程度。將5-Fu和PD單用及兩藥聯(lián)合處理正常胃癌細胞株后,發(fā)現(xiàn)單用和聯(lián)合治療均能降低細胞增殖,增加細胞凋亡率。此細胞增殖的抑制作用和凋亡情況的增加在FGFR4過表達的胃癌細胞株中得到明顯改善。但5-Fu和PD的聯(lián)合治療的價值和前景還需要我們進一步驗證,為臨床提供治療依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
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本文編號：
2364414
