【摘要】：研究目的：利用原子力顯微鏡研究肝癌侵襲能力與細(xì)胞骨架力學(xué)重塑的關(guān)系,探明肝癌侵襲過程中的力學(xué)特性。并探討NRP1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的原子力學(xué)特性的影響。研究方法：1.楊氏模量及骨架重塑對肝癌細(xì)胞侵襲的影響(1)以不同侵襲能力肝癌細(xì)胞系(MHCC-97H細(xì)胞、MHCC-97L細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞)為研究對象,通過原子力顯微鏡對各細(xì)胞進行表面形態(tài)掃描,分別對各細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)和胞核區(qū)的楊氏模量進行測量。(2)以不同侵襲能力肝癌細(xì)胞系(MHCC-97H細(xì)胞、MHCC-97L細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞)為研究對象,采用免疫熒光染色法對細(xì)胞骨架微絲F-Actin進行熒光染色,對熒光染色結(jié)果進行拍攝并探討不同侵襲能力肝癌細(xì)胞細(xì)胞骨架重塑特性(3)以不同侵襲能力肝癌細(xì)胞系(MHCC-97H細(xì)胞、MHCC-97L細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞)為研究對象,利用細(xì)胞劃痕實驗對四株肝癌細(xì)胞的遷移能力進行測定,并探討細(xì)胞遷移能力與細(xì)胞力學(xué)參數(shù)(楊氏模量)的關(guān)系。2.NRP1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞力學(xué)參數(shù)的影響(1)以肝癌細(xì)胞(MHCC-97H細(xì)胞、HCCLM3細(xì)胞)為研究對象,制備NRP1基因沉默肝癌細(xì)胞(MHCC97H-shNRP1細(xì)胞、HCCLM3-shNRP1細(xì)胞)及其空白對照組(MHCC97H-NC細(xì)胞、HCCLM3-NC細(xì)胞),通過原子力顯微鏡對單個細(xì)胞進行表面形態(tài)掃描,得到單個細(xì)胞的細(xì)胞高度圖(Height),偏折圖(Error Signal)和3D圖(3D),觀察細(xì)胞表面形態(tài)并分別測量胞質(zhì)區(qū)和胞核區(qū)的平均粗糙度。(2)以肝癌細(xì)胞(MHCC-97H細(xì)胞、HCCLM3細(xì)胞)為研究對象,制備NRP1基因沉默肝癌細(xì)胞(MHCC97H-shNRP1細(xì)胞、HCCLM3-shNRP1細(xì)胞)及其空白對照組(MHCC97H-NC細(xì)胞、HCCLM3-NC細(xì)胞),通過原子力顯微鏡對單個細(xì)胞的楊氏模量進行測量。(3)以肝癌細(xì)胞(MHCC-97H細(xì)胞、HCCLM3細(xì)胞)為研究對象,制備NRP1基因沉默肝癌細(xì)胞(MHCC97H-shNRP1細(xì)胞、HCCLM3-shNRP1細(xì)胞)及其空白對照組(MHCC97H-NC細(xì)胞、HCCLM3-NC細(xì)胞),通過原子力顯微鏡對單個細(xì)胞的粘彈力(以Residual RMS進行描述)進行測量。3.統(tǒng)計學(xué)方法定量資料采用IBM SPSS 21進行正態(tài)性檢驗,非正態(tài)性分布資料以“中位數(shù)(Median)和上、下分位數(shù)間距(25%,75%)”表示,兩組獨立樣本比較采用Wilcoxon秩和檢驗,多個獨立樣本間采用Kruskal-Wallis H檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。正態(tài)性分布資料以“均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示,使用t檢驗,單因素方差分析進行比較,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。實驗結(jié)果：1.楊氏模量及骨架重塑對肝癌細(xì)胞侵襲的影響(1)按細(xì)胞侵襲力由低至高排序細(xì)胞株胞質(zhì)區(qū)楊氏模量(Pa)測量結(jié)果(Median(25%,75%))分別為：Huh-7細(xì)胞為1608.43(845.48,3317.25),SMMC-7721細(xì)胞為1055.28(367.48,2280.77),MHCC-97L細(xì)胞為1026.78(369.20,2019.96),MHCC-97H細(xì)胞為503.12(366.11,700.31),由此可見,隨著細(xì)胞侵襲能力增強,細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)楊氏模量逐漸降低(P0.01)；按細(xì)胞侵襲力由低至高排序細(xì)胞株胞核區(qū)楊氏模量(Pa)測量結(jié)果(Median (25%,75%))分別為：Huh-7細(xì)胞為2823.98(1262.78,4440.07),SMMC-7721細(xì)胞為1313.43(590.71,2678.62),MHCC-97L細(xì)胞為1285.17(583.29,1961.19),MHCC-97H細(xì)胞為655.57(441.29,943.39),由此可見,隨著細(xì)胞侵襲能力增強,細(xì)胞胞核區(qū)楊氏模量逐漸降低(P0.01)；同時同種肝癌細(xì)胞的胞核區(qū)的楊氏模量高于胞質(zhì)區(qū)。(2)鏡下可見隨著細(xì)胞侵襲能力增強,細(xì)胞骨架完整性越差,微絲分布越紊亂,且近胞核區(qū)域較胞質(zhì)區(qū)遠(yuǎn)端更加致密。其中侵襲能力最弱的Huh-7細(xì)胞細(xì)胞骨架規(guī)則完整,侵襲能力第3的SMMC-7721細(xì)胞微絲完整性和規(guī)律性下降,侵襲能力第2的MHCC-97L細(xì)胞微絲不完整、分布紊亂,而侵襲能力最強的MHCC-97H細(xì)胞更是出現(xiàn)微絲斷裂扭曲的現(xiàn)象。(3)劃痕實驗中MHCC-97H細(xì)胞24h遷移率為46.67%、48h遷移率為86.47%,MHCC-97L細(xì)胞24h遷移率為45.70%、48h遷移率為82.86%,SMMC-7721細(xì)胞24h遷移率為39.41%、48h遷移率為79.85%,Huh-7細(xì)胞24h遷移率為34.60%、48h遷移率為72.09%,表現(xiàn)出了按照MHCC-97H、MHCC-97L、 SMMC-7721、Huh-7的順序逐漸降低的趨勢。2.NRP1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞力學(xué)參數(shù)的影響(1)MHCC97H-NC細(xì)胞的高度大約為5.5μm,表面粗糙不均,其細(xì)胞質(zhì)區(qū)平均粗糙度為283.25±31.26nm,而細(xì)胞核區(qū)的平均粗糙度為382.78±78.10nm。MHCC97H-shNRP1細(xì)胞高度約為4.5μm,表面粗糙不均,其細(xì)胞質(zhì)區(qū)平均粗糙度為30.23±7.17 nm,而細(xì)胞核區(qū)的平均粗糙度為271.75±74.59 nm。經(jīng)NRP1基因沉默的MHCC97H-shNRP1細(xì)胞具有相對平滑的膜表面；HCCLM3-NC細(xì)胞的高度大約為6.5μm,表面粗糙不均,其細(xì)胞質(zhì)區(qū)平均粗糙度為147.95±15.53nm,而細(xì)胞核區(qū)的平均粗糙度為315.83±57.55nm。HCCLM3-shNRP1細(xì)胞高度約為5.7μm,表面粗糙不均,其細(xì)胞質(zhì)區(qū)平均粗糙度為16.03±2.18nm,而細(xì)胞核區(qū)的平均粗糙度為135.70±29.69nm。經(jīng)NRP1基因沉默的HCCLM3-shNRP1細(xì)胞具有相對平滑的膜表面。(2)MHCC97H-NC細(xì)胞楊氏模量為3888.91±110.17Pa,MHCC97H-shNRPl細(xì)胞楊氏模量為4687.06±123.03 Pa。經(jīng)沉默NRP1基因處理的細(xì)胞楊氏模量明顯上升(P0.01)；HCCLM3-NC細(xì)胞楊氏模量為1982.01±66.13 Pa,HCCLM3-shNRP1細(xì)胞楊氏模量為2863.61±55.27 Pa。經(jīng)沉默NRP1基因處理的細(xì)胞楊氏模量明顯上升(P0.01)。(3) MHCC97H-NC細(xì)胞粘彈力為81.55±2.53 pN, MHCC97H-shNRP1細(xì)胞粘彈力為65.61±2.41 pN。經(jīng)沉默NRP1基因處理的細(xì)胞粘彈力明顯下降(P0.05)；HCCLM3-NC細(xì)胞粘彈力為123.18±2.90 pN,HCCLM3-shNRP1細(xì)胞粘彈力為97.89士3.56 pN。經(jīng)沉默NRP1基因處理的細(xì)胞粘彈力明顯下降(P0.01)。結(jié)論：侵襲能力越強的肝癌細(xì)胞楊氏模量越低,細(xì)胞越軟,形變能力越強；同時,細(xì)胞骨架完整性越差,結(jié)構(gòu)越趨于紊亂,反之亦然。經(jīng)NRP1基因沉默后的肝癌細(xì)胞細(xì)胞胞膜表面粗糙度明顯降低。經(jīng)NRP1基因沉默的肝癌細(xì)胞楊氏模量明顯升高且粘彈力顯著降低。細(xì)胞的楊氏模量及粘彈力可能提示腫瘤的惡性程度,楊氏模量越低、粘彈力越高,形變能力越強,腫瘤細(xì)胞的侵襲能力越高,腫瘤細(xì)胞細(xì)胞骨架的破壞和／或重塑影響其轉(zhuǎn)移潛能,其生物力學(xué)性質(zhì)的改變標(biāo)志著其轉(zhuǎn)移潛能的大小,因此可以作為監(jiān)測癌癥侵襲能力及復(fù)發(fā)預(yù)后的新指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：2319837