【摘要】：糖基化改變是癌細(xì)胞的普遍特征,腫瘤發(fā)生時,一方面蛋白質(zhì)和脂分子糖基化的異常而導(dǎo)致糖蛋白和糖脂中的糖鏈發(fā)生了結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變,另一方面和這些糖鏈相互作用的糖結(jié)合蛋白(Glycan-binding proteins, GBPs)的表達(dá)也發(fā)生變化。開展腫瘤糖蛋白糖鏈和GBPs的研究對于闡明腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制及其對于腫瘤的診斷和治療都具有非常重要的意義。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的最新資料表明,肝癌是全球最常見的五種惡性腫瘤之一,位居惡性腫瘤死亡率的第二位。我國90%以上的肝癌為肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC),75%-80%的HCC發(fā)病與肝臟慢性病毒性感染有關(guān),世界范圍內(nèi)80%-90%的HCC患者伴隨有肝纖維化。雖然,目前研究表明：在肝病的炎癥、纖維化、癌變的過程中均有糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的改變,但是糖蛋白糖鏈合成通路及與其相互作用的GBPs的表達(dá)是如何發(fā)生變化則了解不多。本論文首先運用凝集素芯片對肝癌發(fā)生發(fā)展中膜糖蛋白糖鏈譜進(jìn)行研究,并用凝集素組化確定差異性表達(dá)的糖鏈在細(xì)胞中的分布、定位情況。在肝纖維化模型中,14種凝集素(如Jacalin、MAL-Ⅱ和AAL)和3種凝集素(SJA, EEL和ConA)識別的糖鏈結(jié)構(gòu)分別在激活態(tài)LX-2細(xì)胞膜糖蛋白中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。在肝癌模型中,肝癌細(xì)胞系HepG2膜糖蛋白中12種凝集素(如Jacalin、MAL-Ⅱ、LTL和LEL)的表達(dá)信號增強(qiáng),6種凝集素(如WFA、PTL-Ⅰ、WGA和UEA-I)表達(dá)信號降低；肝癌細(xì)胞系SMMC-7721膜糖蛋白中11種凝集素(如Jacalin、MAL-Ⅱ、SJA和LTL)表達(dá)信號增強(qiáng),13種凝集素(如ECA、WFA、GSL-Ⅱ和PTL-I)表達(dá)信號降低,同時,10種凝集素(如ECA、GSL-Ⅱ、PTL-Ⅰ和LEL)在兩種肝癌細(xì)胞系膜糖蛋白中差異表達(dá),其中8種凝集素(如BCA、GSL-Ⅱ、PTL-Ⅰ和LEL)識別的糖鏈結(jié)構(gòu)在HepG2膜糖蛋白中較SMMC-7721中顯著性高表達(dá),2種凝集素(Jacalin和VVA)識別的糖鏈結(jié)構(gòu)在HepG2膜糖蛋白中較SMMC-7721中顯著性低表達(dá)。凝集素組化結(jié)果顯示差異性表達(dá)的糖鏈主要分布在細(xì)胞的細(xì)胞膜,核周胞質(zhì)區(qū)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體)上,這些數(shù)據(jù)為尋找膜糖蛋白糖基化與肝纖維化發(fā)生的關(guān)聯(lián)性及肝癌的早期診斷、抗腫瘤藥物的研發(fā)提供有用信息。利用糖基因芯片對肝癌發(fā)生發(fā)展中細(xì)胞內(nèi)糖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究,然后用實時熒光定量PCR和Western blot對差異性表達(dá)的糖相關(guān)基因和蛋白進(jìn)行驗證。在肝纖維化模型中,39種糖相關(guān)基因在激活態(tài)LX-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平顯著高表達(dá),36種糖相關(guān)基因在激活態(tài)LX-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平顯著低表達(dá)。在肝纖維化發(fā)生過程中,共有75種探針對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變,約占總探針數(shù)的18.66%。在190種糖酶基因探針中,42種探針對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變,約占糖酶基因探針總數(shù)22.11%。在肝癌模型中,分別有29種和37種糖相關(guān)基因在肝癌細(xì)胞系HepG2中轉(zhuǎn)錄本的RNA水平上調(diào)和下調(diào)；分別有19種和14種糖相關(guān)基因在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)錄水平顯著性高表達(dá)和低表達(dá),有272+93種探針顯示有效結(jié)合信號,約占探針67.66%,在190種糖酶基因探針種,有114+21種探針顯示有效結(jié)合信號,約占糖酶基金探針的60.00%。通過比較發(fā)現(xiàn),糖酶基因變化的比例較其他基因變化的比例要高,此結(jié)果說明,在肝癌發(fā)生發(fā)展中與糖鏈合成調(diào)控相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)錄水平明顯改變,說明蛋白糖基化的變化是肝癌發(fā)生發(fā)展中的一項重要的生理變化。肝癌發(fā)生發(fā)展中,糖相關(guān)基因主要參與了N-/O-糖鏈合成、硫酸角質(zhì)素合成、硫酸軟骨素合成、硫酸乙酰肝素合成及糖胺聚糖降解通路等,在上調(diào)的糖相關(guān)基因代謝通路中,以N-糖鏈合成通路為例加以說明基因的改變。在此通路中主要涉及ALG2、ALG8、ALG10、CST、MGAT3、 MGAT4及MGAT5等糖相關(guān)基因的改變,這些基因主要與N-糖鏈前體的合成有關(guān),如ALG2與Dol-P-Glc糖鏈合成有關(guān)；MGAT3與P-Man糖鏈合成有關(guān),其在通路中起正調(diào)節(jié)作用,而其他基因起輔助調(diào)控作用。下調(diào)基因參與的代謝通路,以糖胺聚糖降解通路為例,在此通路中,主要涉及HYAL、IDUA、NAGLU、GUSB等糖相關(guān)基因,這些基因主要與抑制糖鏈合成或與糖鏈的降解有關(guān),起負(fù)調(diào)控作用。使用糖芯片對肝癌發(fā)生發(fā)展中差異性表達(dá)的GBPs進(jìn)行研究。在肝纖維化模型中,12種糖探針(如Gal、GalNAc和Man-9Glycan)識別的GBPs在激活態(tài)LX-2細(xì)胞中表達(dá)水平顯著增加,7種糖探針(如NeuAc、Lac和GlcNAc-O-Ser)識別的GBPs在激活態(tài)LX-2中表達(dá)水平顯著降低。在肝癌模型中,8種糖探針(如SL、LNT和GalNAc)識別的GBPs在肝癌細(xì)胞系HepG2中顯著性高表達(dá)；5種糖探針(如Man、 Man-9-Glycan和Xyl)識別的GBPs在肝癌細(xì)胞系HepG2中顯著低表達(dá)。糖細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,GBPs主要分布在細(xì)胞的細(xì)胞膜、中央胞質(zhì)區(qū)及核周胞質(zhì)區(qū)。通過對肝癌發(fā)生發(fā)展中GBPs的研究,希望能夠準(zhǔn)確了解肝癌發(fā)生發(fā)展中GBPs的變化,為揭示GBPs與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供理論依據(jù),并為尋找肝癌相關(guān)腫瘤潛在標(biāo)志物的研究提供新思路。利用質(zhì)譜技術(shù)對肝纖維化發(fā)生中差異性表達(dá)的GBPs進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,半乳糖胺糖結(jié)合蛋白(GaINAc-binding proteins, GNBPs)鑒定結(jié)果如下：分別從激活態(tài)和靜息態(tài)LX-2細(xì)胞中鑒定到264種和257種GNBPs,通過峰面積定量,分別有46種和40種GNBPs在激活態(tài)LX-2細(xì)胞中差異性高表達(dá)和低表達(dá)。木糖糖結(jié)合蛋白(Xy1-binding proteins, XBPs)鑒定結(jié)果如下：分別從激活態(tài)和靜息態(tài)LX-2細(xì)胞中鑒定到70種和64種XBPs,通過峰面積定量對鑒定到的XBPs進(jìn)行分析,有30種XBPs在激活態(tài)LX-2顯著高表達(dá),有14種XBPs在激活態(tài)LX-2中顯著低表達(dá)。這些差異性表達(dá)的蛋白主要參與蛋白結(jié)合功能和催化功能等。通過Western blot和血清芯片對鑒定到的GBPs (如PDIA6和APOA1)進(jìn)一步研究,結(jié)果顯示PDIA6和APOA1的ROC曲線的線下面積(Area Under Curves, AUCs)均大于0.8,PDIA6的AUCs為0.8985(0.8132-0.9838,p0.0001), APOA1的AUCs為0.8738(0.7830-0.9646,p0.0001),說明PDIA6和APOA1作為腫瘤潛在標(biāo)志物的診斷具有一定的準(zhǔn)確性,亦有95%的幾率將肝纖維化/肝硬化患者與健康人通過血清診斷的方式區(qū)分開來,說明GBPs可用作為腫瘤潛在標(biāo)志物并用于后續(xù)研究。最后對罹患系列肝病(HBV引起的乙肝、肝硬化和肝癌)患者唾液中糖蛋白SAa2-3/6糖鏈結(jié)構(gòu)與易感流感病毒關(guān)系進(jìn)行研究,用8株禽流感病毒毒株(H5、H7和H9亞型)及H1N1滅活病毒疫苗(擬人流感病毒)與肝病患者及健康人唾液進(jìn)行印記實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝病患者唾液中糖蛋白SAα2-3糖鏈結(jié)構(gòu)的豐度較同年齡同性別的健康人唾液中的顯著降低,提示肝病患者易感染禽流感；而肝病患者唾液中糖蛋白SAa2-6糖鏈結(jié)構(gòu)的豐度較同年齡同性別的健康人唾液中的略高或沒有顯著差別,提示肝病患者具有較強(qiáng)或正常的抵抗人流感病毒的能力。本研究又對其他慢性病(如二型糖尿病(T2DM)、胃癌)患者與易感流感病毒的關(guān)系進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),T2DM患者屬于流感病毒易感人群,而胃癌患者唾液中的SAa2-3和a2-6糖鏈結(jié)構(gòu)豐度與同年齡同性別的健康人唾液中的差別不大,提示胃癌患者具有正常的禽流感病毒和人流感病毒的抵抗能力。本研究建立了一款用于篩查禽流感和人流感病毒易感人群的凝集素芯片,通過唾液快速簡便檢測篩查流感病毒易感人群,為防控禽流感及治療提供了新方法。
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【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 鐘耀剛;秦鑫敏;杜昊騏;黨劉毅;李錚;;肝癌細(xì)胞系差異性表達(dá)的糖結(jié)合蛋白研究[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2014年11期

2 鐘耀剛;秦h覬，

本文編號：2316528