發(fā)布時間：2018-11-06 14:12

【摘要】：目的：1.體外實(shí)驗(yàn)建立高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞MHCC97H和低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞MHCC97L的常氧和缺氧細(xì)胞模型,觀察在常氧和缺氧條件下羅勒多糖對兩種細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和侵襲能力的影響,并進(jìn)一步研究羅勒多糖對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因、蛋白的影響,探討羅勒多糖抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立MHCC97H肝癌細(xì)胞裸鼠皮下荷瘤模型和walker-256細(xì)胞大鼠移植性肝癌模型,并對移植性肝癌大鼠進(jìn)行肝動脈結(jié)扎術(shù)(HAL),造成腫瘤組織缺氧,觀察羅勒多糖對兩種模型腫瘤的影響,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討羅勒多糖抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的關(guān)系。方法：1.采用濃度為200μmol·l-1的二氯化鉆(CoCl2)誘導(dǎo)細(xì)胞體外缺氧,建立MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞缺氧模型,細(xì)胞在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)。常氧條件下將兩種細(xì)胞分別分為正常組、羅勒多糖低劑量組、羅勒多糖中劑量組和羅勒多糖高劑量組,缺氧條件下將兩種細(xì)胞分為正常組、缺氧模型組、羅勒多糖低劑量組、羅勒多糖中劑量組和羅勒多糖高劑量組,分別給予200、400和800μg·ml-1的羅勒多糖作用24小時,MTT法檢測常氧和缺氧條件下羅勒多糖對細(xì)胞增殖能力的影響,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測羅勒多糖對細(xì)胞遷移能力的影響,transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測羅勒多糖對細(xì)胞侵襲能力的影響,實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測羅勒多糖對細(xì)胞HIF-1 a、E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin、Vimentin、 VMP1和ZO-1 mRNA表達(dá)水平的影響,Western-blot法檢測羅勒多糖對細(xì)胞中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1蛋白表達(dá)水平的影響。2.將MHCC97H細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)肋腰部皮下,建立裸鼠皮下荷瘤模型,造模成功后根據(jù)腫瘤體積隨機(jī)分為五組：模型組、索拉非尼組、羅勒多糖低劑量組、羅勒多糖中劑量組和羅勒多糖高劑量組,分別給予生理鹽水、索拉非尼(50mg·kg-1·d-1)、低、中、高劑量羅勒多糖(100、200、400mg·kg-1 · d-1)灌胃,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,測量皮下瘤重量,觀察各組腫瘤重量的變化,計算各藥物的抑瘤率,實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測羅勒多糖對腫瘤組織中HIF-1α、 E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1 mRNA表達(dá)水平的影響,Western-blot法檢測羅勒多糖對腫瘤組織中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1蛋白表達(dá)水平的影響。3.采用walker-256細(xì)胞建立Wistar大鼠移植性肝癌模型,造模成功進(jìn)行肝動脈結(jié)扎術(shù)(HAL),并將實(shí)驗(yàn)大鼠分為5組：模型組(不進(jìn)行HAL)、HAL組、羅勒多糖低劑量組、羅勒多糖中劑量組和羅勒多糖高劑量組,手術(shù)成功后對模型組和HAL組給予生理鹽水灌胃,羅勒多糖低、中、高劑量組給予羅勒多糖(75、150、300mg·kg-1·d-1)灌胃,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,測量肝臟腫瘤體積,計數(shù)腹腔腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目,實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測肝臟腫瘤組織中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、 Vimentin、VMP1和ZO-1 mRNA表達(dá)水平,Western-blot法檢測肝臟腫瘤組織中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1.濃度為200μmol·1的CoCl2作用MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞24小時后,兩種細(xì)胞中HIF-1α mRNA表達(dá)水平顯著升高,與正常組比較有顯著性差異(P0.01)；在濃度為200μmol ·l-1的CoCl2的條件下,兩種細(xì)胞的存活率分別為77.76%和87.76%,細(xì)胞存活率相對較高；因此確定缺氧模型的造模條件為200μmol·l-1的CoCl2作用細(xì)胞24小時。常氧條件下,羅勒多糖對MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞的增殖能力無明顯影響,各組細(xì)胞存活率都接近100%,與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；中劑量羅勒多糖對MHCC97H細(xì)胞的遷移能力有抑制作用,與正常組比較具有顯著性差異(P0.05),羅勒多糖對MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力、MHCC97L細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力均無明顯作用,與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；羅勒多糖可以上調(diào)MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin、ZO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平以及VMP1的蛋白表達(dá)水平,下調(diào)Vimentin mRNA的表達(dá)水平,與正常組比較有顯著性差異(P0.05,P0.01)；羅勒多糖可上調(diào)MHCC97L細(xì)胞中E-cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)水平,與正常組比較有顯著性差異(P0.05,P0.01)。在缺氧條件下,MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng),與正常組比較有顯著性差別(P0.01)；羅勒多糖能抑制MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞的增殖和遷移,并對MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力具有抑制作用,與缺氧模型組比較具有顯著性差異(P0.01,P0.05)；在缺氧條件下,MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞中HIF-1α、N-cadherin、 Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水及β-catenin的蛋白表達(dá)水平升高,E-cadherin、VMP1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；羅勒多糖能下調(diào)MHCC97H細(xì)胞中HIF-1 α、 N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白以及β-catenin的蛋白表達(dá)水平,上調(diào)E-cadherin和VMPl的mRNA和蛋白表達(dá)水平；而在MHCC97L細(xì)胞中,羅勒多糖能上調(diào)E-cadherin的：mRNA和蛋白表達(dá)水平,下調(diào)HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)水平。2. MHCC97H細(xì)胞荷瘤裸鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,羅勒多糖中、大劑量組荷瘤裸鼠體重明顯增加,與模型組比較有顯著性差別(P0.05,P0.01)；低、中、高劑量羅勒多糖和索拉非尼對裸鼠皮下腫瘤的抑瘤率分別為25.15%、14.72%、46.63%和55.58%,與模型組比較均無顯著性差異；羅勒多糖能下調(diào)腫瘤組織中HIF-1α、Vimentin、 N-cadherin的mRNA和蛋白以及β-catenin的蛋白表達(dá),上調(diào)E-cadherin、VMP1、ZO-1的mRNA和蛋白的表達(dá),與模型組比較有顯著性差別(P0.05,P0.01)；索拉非尼能上調(diào)腫瘤組織中E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá),下調(diào)β-catenin的蛋白表達(dá),下調(diào)N-cadherin mRNA的表達(dá)以及Vimentin mRNA和蛋白的表達(dá),與模型組比較有顯著性差別(P0.01)。3.大鼠移植性肝癌模型結(jié)果顯示,肝動脈結(jié)扎術(shù)(HAL)能明顯縮小大鼠肝臟腫瘤體積,與不進(jìn)行HAL術(shù)的模型組比較有顯著性差別(P0.05),但HAL術(shù)后腫瘤腹腔轉(zhuǎn)移灶數(shù)目(36±8個)明顯增多,與模型組(11±3個)比較有顯著性差別(P0.01)；經(jīng)HAL術(shù)后,腫瘤組織中HIF-1α、N-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,β-catenin的蛋白表達(dá)水平升高,E-cadherin、VMP1的mRAN和蛋白表達(dá)水平降低；經(jīng)羅勒多糖干預(yù)后,羅勒多糖中、高劑量組腫瘤腹腔轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯減少,分別為(22±4個)和(19±6個),與HAL組比較有顯著性差別(P0.05,P0.01)；羅勒多糖能下調(diào)腫瘤組織中HIF-1 α、N-cadherin Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá),下調(diào)β-catenin的蛋白表達(dá),上調(diào)E-cadherin、VMP1的mRNA和蛋白表達(dá),與HAL組比較有顯著性差別(P0.05,P0.01)。結(jié)論：1.缺氧能促進(jìn)MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞EMT的發(fā)生。在缺氧條件下,MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)上調(diào),同時細(xì)胞中與EMT相關(guān)的E-cadherin VMP1的表達(dá)下調(diào),β-catenin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)上調(diào),引起EMT的發(fā)生,使細(xì)胞的運(yùn)動能力和侵襲能力增強(qiáng),加速了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.羅勒多糖能抑制MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞EMT的發(fā)生,這一作用與腫瘤缺氧微環(huán)境密切相關(guān),并具有細(xì)胞差異性,對轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的MHCC97H細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的作用。對MHCC97H細(xì)胞,羅勒多糖能通過調(diào)節(jié)缺氧條件下HIF-1α的表達(dá)以及EMT相關(guān)的E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1的表達(dá),影響EMT的發(fā)生,抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動能力；而對MHCC97L細(xì)胞,羅勒多糖僅通過調(diào)節(jié)缺氧條件下HIF-1α的表達(dá)和EMT相關(guān)的E-cadherin的表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力,對侵襲能力無明顯作用。3.羅勒多糖和索拉非尼都能通過抑制EMT起到治療腫瘤的作用,但作用機(jī)制不同。羅勒多糖主要是通過改善腫瘤缺氧微環(huán)境,下調(diào)HIF-1α的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)EMT相關(guān)的E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1、ZO-1表達(dá),抑制EMT的發(fā)生；而索拉非尼不能改善腫瘤缺氧微環(huán)境,但其能通過調(diào)節(jié)E-cadherin、β-catenin和Vimentin的蛋白表達(dá)起到抑制EMT的作用。4.羅勒多糖能從多個方面對腫瘤產(chǎn)生影響,從而起到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)和前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),羅勒多糖能改善腫瘤缺氧微環(huán)境、抑制腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生、增強(qiáng)機(jī)體免疫力進(jìn)而改善實(shí)驗(yàn)動物生存狀態(tài),其抗腫瘤轉(zhuǎn)移是多靶點(diǎn)、多途徑共同作用的結(jié)果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2314513