【摘要】：研究背景及目的:食管癌在我國的消化系統(tǒng)腫瘤中占有重要的比例,河南省是食管癌的高發(fā)地區(qū)。食管癌在早期不易被發(fā)現(xiàn),大多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期階段,腫瘤的進(jìn)展快,容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在我國的食管癌患者中,主要的病理類型為食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)。隨著醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展,食管癌的治療效果已取得了相當(dāng)大的進(jìn)步,但是仍有大部分的患者在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的情況,患者的生存期并未出現(xiàn)明顯的改善,治療效果不佳。因此尋找新的食管癌的治療途徑就顯得尤為重要。隨著近幾年分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,腫瘤相關(guān)基因研究的深入,基因治療及分子靶向治療已經(jīng)成為目前腫瘤治療的新方向,而在這之中重要的是如何選擇特異性的分子靶點(diǎn)。L1細(xì)胞粘附分子(L1 Cell Adhesion Molecule,L1CAM)屬于細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白超家族。在研究的初始階段,L1CAM分子被發(fā)現(xiàn)是在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起到重要的作用。后來發(fā)現(xiàn)它在腫瘤中也出現(xiàn)有異常的表達(dá),包括在卵巢癌,惡性黑色素瘤,乳腺癌,前列腺癌,子宮內(nèi)膜癌中,并且認(rèn)為L1CAM與患者預(yù)后差和疾病的終末階段相關(guān),提示L1CAM是一個(gè)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的基因。L1CAM作為靶向治療的靶點(diǎn)具有很多優(yōu)勢,首先這是一個(gè)在腫瘤進(jìn)程中很重要的分子,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),侵襲和轉(zhuǎn)移;在卵巢癌或者胰腺癌等多種腫瘤中高表達(dá),可用于傳統(tǒng)化療療效不佳,預(yù)后差的患者;具有組織選擇性,L1CAM一般表達(dá)于成人器官的外周神經(jīng)和腎小管細(xì)胞。然而目前L1CAM在食管鱗癌中的表達(dá)情況還屬未知,在食管癌進(jìn)展中的作用還不清楚。本文通過對(duì)L1CAM在食管鱗癌中的表達(dá)及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析,了解L1CAM在食管鱗癌中的表達(dá)及作用,跟患者的臨床參數(shù)相關(guān)性如何,和食管癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系怎樣,抑制L1CAM的表達(dá)能否抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖,侵襲及運(yùn)動(dòng)能力,在動(dòng)物模型中驗(yàn)證,并對(duì)L1CAM的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。第一部分L1CAM在食管鱗癌患者中的表達(dá)及與患者臨床參數(shù)的分析方法1)用Real time PCR的方法檢測食管癌患者癌和癌旁正常食管黏膜組織中L1CAM的表達(dá)。2)分析L1CAM m RNA表達(dá)水平與患者臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系。3)用免疫組化的方法檢測食管癌患者癌組織中L1CAM蛋白的表達(dá)。4)分析L1CAM蛋白表達(dá)水平與患者臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系。5)L1CAM蛋白表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析。結(jié)果1)117對(duì)食管癌患者的癌組織中L1CAM m RNA的表達(dá)顯著高于癌旁正常食管粘膜組織,P0.01,癌中L1CAM表達(dá)水平高于癌旁兩倍以上的病例占56.41%。2)L1CAM m RNA的表達(dá)水平與患者腫瘤的分化程度、侵襲程度和腫瘤的臨床分期具有顯著相關(guān)性,P0.05。3)69例食管癌患者腫瘤組織中L1CAM蛋白的陽性表達(dá)率為78.26%。4)L1CAM蛋白的表達(dá)水平與患者腫瘤侵襲程度、分化程度、腫瘤的分期及患者的生存顯著相關(guān),P0.05。5)L1CAM蛋白高表達(dá)組的患者的總生存率顯著低于L1CAM低表達(dá)組患者,P0.05。小結(jié)1)在食管癌患者的癌組織中L1CAM m RNA的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織,m RNA及蛋白的表達(dá)水平與患者的臨床病理參數(shù)相關(guān)。提示L1CAM可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。2)L1CAM蛋白的表達(dá)與患者的生存期顯著相關(guān),提示L1CAM可能是判斷食管癌患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。第二部分L1CAM的表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞系TE1和EC1生物學(xué)行為的影響方法1)用Real time PCR的方法檢測L1CAM在多種食管癌細(xì)胞系及正常食管永生化細(xì)胞中的表達(dá)水平。2)構(gòu)建L1CAM穩(wěn)定低表達(dá)的sh RNA慢病毒感染的TE1和EC1細(xì)胞。3)CCK8的方法檢測L1CAM表達(dá)的下調(diào)對(duì)食管癌TE1和EC1細(xì)胞增殖的影響。4)流式細(xì)胞術(shù)檢測L1CAM表達(dá)下調(diào)對(duì)食管癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。5)在低粘附板中觀察L1CAM表達(dá)下調(diào)對(duì)食管癌細(xì)胞成球能力的影響。6)Transwell系統(tǒng)觀察L1CAM表達(dá)下調(diào)對(duì)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。7)建立裸鼠移植瘤模型,觀察L1CAM表達(dá)下調(diào)對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響。結(jié)果1)L1CAM在食管癌細(xì)胞TE1和EC1中表達(dá)相對(duì)較高,選擇這兩個(gè)細(xì)胞系構(gòu)建L1CAM穩(wěn)定低表達(dá)的食管癌細(xì)胞。2)用Real time PCR和Wester blot的方法驗(yàn)證L1CAM敲低的效率,即L1CAM在m RNA及蛋白水平表達(dá)降低。3)L1CAM表達(dá)的降低能夠抑制食管癌細(xì)胞的增殖。4)L1CAM表達(dá)的降低能夠阻滯食管癌細(xì)胞的周期于G0/G1期,并且使腫瘤細(xì)胞的凋亡增加。5)L1CAM表達(dá)的降低能夠抑制食管癌細(xì)胞的成球能力。6)L1CAM表達(dá)的降低能夠使腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力減弱。7)在裸鼠移植瘤模型中,L1CAM的表達(dá)降低使裸鼠腫瘤的形成能力減弱,形成腫瘤的體積和質(zhì)量均減小。小結(jié)1)L1CAM表達(dá)降低,能夠降低食管癌細(xì)胞的增殖及自我更新能力,阻滯細(xì)胞周期,降低食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力,提示L1CAM在食管癌的惡性行為中起到了重要的作用。2)L1CAM表達(dá)降低,在裸鼠動(dòng)物模型中發(fā)揮抑制腫瘤的形成和發(fā)展的作用。第三部分L1CAM通過調(diào)控NF-kB的活性促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的招募方法1)細(xì)胞因子微球檢測技術(shù)分析L1CAM敲低以后食管癌細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的變化,選出變化差異最大的因子,并用ELISA及Real time PCR進(jìn)行驗(yàn)證。2)體外Transwell系統(tǒng)中檢測L1CAM表達(dá)降低以后對(duì)健康人外周血CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞的招募作用的變化。3)在裸鼠移植瘤模型中給裸鼠注射健康人外周血CD4+T細(xì)胞,驗(yàn)證L1CAM表達(dá)降低對(duì)Treg細(xì)胞的招募作用的變化。4)Real time PCR和免疫組化的方法檢測裸鼠腫瘤部位L1CAM、CCL22、FOXP3和CCR4的表達(dá)。5)Western blot的方法檢測L1CAM表達(dá)降低后對(duì)NF-kB活性的影響,并用ELISA及Real time PCR檢測用NF-kB抑制劑處理以后的TE1細(xì)胞CCL22的表達(dá)水平。6)用Real time PCR和流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測和分析食管癌患者腫瘤組織中L1CAM m RNA的表達(dá)水平與腫瘤組織中Treg細(xì)胞的數(shù)量的相關(guān)性。7)用Kaplan Meier生存曲線分析食管癌患者腫瘤組織中CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞所占比例與患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果1)隨著L1CAM表達(dá)的降低,TE1細(xì)胞上清中CCL22的表達(dá)變化最明顯,呈顯著降低。2)在體外試驗(yàn)中,L1CAM表達(dá)降低使CCL22表達(dá)下調(diào),從而使招募到腫瘤細(xì)胞部位的Treg細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。3)體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果表明,隨著L1CAM表達(dá)的降低,趨化到腫瘤部位的Treg細(xì)胞明顯減少。4)在體內(nèi)試驗(yàn)中,L1CAM表達(dá)降低,使腫瘤部位CCL22、FOXP3、CCR4的m RNA及蛋白水平表達(dá)降低。5)L1CAM表達(dá)降低可以抑制NF-kB的活性;使用NF-kB抑制劑處理腫瘤細(xì)胞TE1后,腫瘤細(xì)胞分泌CCL22的水平降低。6)腫瘤患者癌組織中L1CAM m RNA的表達(dá)與Treg細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān),P0.05。7)食管癌患者腫瘤組織中Treg細(xì)胞所占越高,患者的預(yù)后越差。小結(jié)1)在食管癌細(xì)胞TE1中隨著L1CAM表達(dá)降低,TE1細(xì)胞表達(dá)的CCL22的水平降低,從而使招募的Treg細(xì)胞的數(shù)量減少。2)在患者的腫瘤組織中L1CAM的表達(dá)與患者腫瘤組織中浸潤的Treg細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān),并且Treg細(xì)胞的數(shù)量與患者預(yù)后具有相關(guān)性。3)L1CAM通過調(diào)節(jié)NF-kB的活性來調(diào)節(jié)CCL22的表達(dá)。結(jié)論1)L1CAM在食管癌患者的腫瘤組織中表達(dá)顯著升高,并且與患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后相關(guān),說明L1CAM在食管癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。2)L1CAM的表達(dá)降低能夠降低食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力,阻滯細(xì)胞周期、增加腫瘤細(xì)胞的凋亡。3)L1CAM的表達(dá)降低能夠下調(diào)食管癌細(xì)胞CCL22的表達(dá),從而使招募到腫瘤部位的Treg細(xì)胞減少,這一作用是通過降低NF-?B的活性來實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2308526