【摘要】：食管癌(esophageal carcinoma, EC)是全球第八大惡性腫瘤,死亡率高,5年生存率不到15%。在我國(guó),食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是最常見的病理類型,具有易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。對(duì)于早期病人,手術(shù)切除是主要的治療手段；中晚期病人則以放化療為主,但治療效果并不理想。然而,因?yàn)槿狈Φ湫偷呐R床癥狀和有效的早期診斷技術(shù),食管癌發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已是中晚期,因此,尋找一種早期發(fā)現(xiàn)食管癌的方法顯得尤為重要。從分子水平了解食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,探索出有效的診斷及治療靶點(diǎn),對(duì)于食管癌的早期診斷及治療具有深遠(yuǎn)意義。微小RNAs (miRNAs)是一類長(zhǎng)約19-22個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通過連接靶基因的3'-UTR區(qū)域來發(fā)揮多重作用。目前已經(jīng)在206種生物中發(fā)現(xiàn)了miRNAs,從微生物到動(dòng)物均有涉及。miRBase官方網(wǎng)站上公布了2000多個(gè)miRNAs,預(yù)計(jì)超過60%的人類蛋白編碼基因都會(huì)受到miRNAs的調(diào)控。miRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、侵襲、血管生成及細(xì)胞凋亡方面均發(fā)揮了重要作用。miRNAs的表達(dá)異常與惡性腫瘤密切相關(guān),多種miRNAs參與食管癌的發(fā)生及發(fā)展過程,其中miR-183、miR-142、miR-483高表達(dá),發(fā)揮了癌基因的作用,而miR-375、miR-98、miR-214、miR-143在食管癌中低表達(dá),發(fā)揮了抑癌基因的作用。近年來大量研究表明,miR-373在多種惡性腫瘤中均發(fā)揮了重要作用。Voorhoeve等人于2006年第一次提出miR-373,作為一個(gè)新的癌基因,它在睪丸精原細(xì)胞瘤中通過阻斷p53通路來參與腫瘤的進(jìn)展。它也可以通過作用于靶基因PPP6C調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。而在乳腺癌中,通過監(jiān)測(cè)循環(huán)血中miR-373的表達(dá)含量可以了解是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另外,miR-373通過作用于Rab22a來抑制人卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移,從而發(fā)揮了抑癌基因的作用。基因芯片技術(shù)分析,miR-373在ESCC組織中表達(dá)上調(diào),比正常組織至少高1.5倍。然而,miR-373在ESCC中的作用機(jī)制目前尚不清楚,尤其在血漿中的表達(dá)水平及意義目前尚無研究�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是一系列能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶,通過破壞瘤細(xì)胞周圍的組織學(xué)屏障,促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。MMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制齊(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)在正常人體內(nèi)環(huán)境中處于平衡狀態(tài),由于腫瘤的特性,使兩者之間的平衡被打破,從而提高了腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的能力。其中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3, TIMP3)與惡性腫瘤的關(guān)系密切,作為一種抑癌基因,TIMP3的低表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移,還能抑制細(xì)胞凋亡。另外,通過檢測(cè)TIMP3在膀胱癌及ESCC中的表達(dá)水平,還可以推測(cè)患者的預(yù)后。在以往的研究中,發(fā)現(xiàn)TIMP3與ESCC的遷移及侵襲能力密切相關(guān),而通過生物信息學(xué)軟件的預(yù)測(cè),我們也發(fā)現(xiàn)TIMP3可能為miR-373的靶基因。在本項(xiàng)研究中,我們檢測(cè)了miR-373在ESCC組織及血漿中的表達(dá)水平,并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)使miR-373的表達(dá)上調(diào)或下調(diào),觀察miR-373對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。尋找miR-373的直接靶基因,探討miR-373在ESCC發(fā)病過程中的作用機(jī)制,為ESCC的診斷及治療提供了新的理論依據(jù)。第一部分miR-373在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平及臨床意義目的：測(cè)定miR-373在ESCC組織及術(shù)前血漿中的表達(dá)水平,分析miR-373的異常表達(dá)與ESCC的分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床特征的關(guān)系,探討miR-373在組織及血漿中表達(dá)水平的相關(guān)性。方法：從2012年10月到2014年9月在山東省腫瘤醫(yī)院及泰安市中心醫(yī)院首次診斷為ESCC患者中選取63名,收集腫瘤組織、瘤旁正常組織及術(shù)前外周血,另取39例健康志愿者的外周血作為陰性對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定miR-373在ESCC腫瘤組織及瘤旁正常組織中的表達(dá)水平,同時(shí)檢測(cè)了miR-373在術(shù)前ESCC患者及健康志愿者血漿中的表達(dá)水平。結(jié)果：1.miR-373在63例ESCC腫瘤組織中的表達(dá)水平要顯著高于瘤旁正常組織(P0.01)。miR-373在組織中的表達(dá)水平與分化程度、腫瘤T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P0.05)。2. miR-373在63例ESCC術(shù)前血漿中的表達(dá)水平要顯著高于39例健康志愿者(P0.01)。miR-373在血漿中的表達(dá)水平與腫瘤T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P0.05)。3. Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析得知,miR-373在腫瘤組織中的表達(dá)水平與血漿中的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.553,P0.01)。說明miR-373在組織及血漿中的表達(dá)水平具有一致性。結(jié)論：miR-373在ESCC組織及外周血漿中的表達(dá)均顯著升高,表明miR-373作為癌基因在ESCC的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。第二部分miR-373對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響目的：觀察miR-373表達(dá)水平的變化對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力等生物學(xué)行為的影響,探討miR-373的表達(dá)與ESCC生物學(xué)特性的關(guān)系。方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)4種ESCC細(xì)胞系中miR-373的表達(dá)水平。選取miR-373表達(dá)水平最高的KYSE410和表達(dá)水平最低的ECA109來進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。將miR-373 mimics轉(zhuǎn)染到ECA109細(xì)胞中來提高miR-373的表達(dá)水平,將miR-373 inhibitor轉(zhuǎn)染到KYSE410細(xì)胞中來降低miR-373的表達(dá)水平。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)來評(píng)估ESCC細(xì)胞的增殖能力,凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡的變化,應(yīng)用未覆蓋及覆蓋Matrigel膠的Transwell小室分別來進(jìn)行細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：1.miR-373表達(dá)水平的次序?yàn)镵YSE410 EC9706 TE-1 ECA109。選取miR-373表達(dá)水平最高的KYSE410和表達(dá)水平最低的ECA109來進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。2.在ECA109細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48h后,miR-373 mimics組的細(xì)胞增殖能力要高于陰性對(duì)照組(P0.05)；而轉(zhuǎn)染72h后,兩者之間的區(qū)別更加明顯(P0.01)。在KYSE410細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48h后,miR-373 inhibitor組的細(xì)胞增殖能力低于陰性對(duì)照組(P0.05)；轉(zhuǎn)染72h后,兩者之間的差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這些結(jié)果顯示,miR-373可以提高ESCC細(xì)胞的增殖能力。3. miR-373 mimics組凋亡細(xì)胞所占的比例與陰性對(duì)照組相比,無顯著區(qū)別(P0.05)。而miR-373 inhibitor組凋亡細(xì)胞的比例要高于陰性對(duì)照組(P0.01)。因此,抑制miR-373的表達(dá)可以促進(jìn)ESCC的細(xì)胞凋亡。4.轉(zhuǎn)染miR-373 mimics后ECA109的遷移能力及侵襲能力較陰性對(duì)照組顯著提高(P0.01)。轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor后KYSE410的遷移能力及侵襲能力較陰性對(duì)照組顯著減弱(P0.01)。說明miR-373可以提高ESCC細(xì)胞的遷移及侵襲能力。結(jié)論：miR-373的過表達(dá)可以提高ESCC的細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。抑制miR-373的表達(dá)可以減弱ESCC的細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。第三部分miR-373對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌作用機(jī)制的初步研究目的：miRNAs雖然不編碼蛋白質(zhì),但是可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與mRNA的3'-UTR區(qū)域結(jié)合,導(dǎo)致mRNA的降解或抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯。通過生物信息學(xué)軟件,我們預(yù)測(cè)到miR-373存在多個(gè)潛在靶基因,結(jié)合在ESCC中與侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因,我們選擇TIMP3來進(jìn)行下一步的研究,探索TIMP3是否為miR-373的直接靶基因來影響ESCC細(xì)胞的生物學(xué)行為。方法：檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后ESCC細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)的差異,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TIMP3是否為niR-373的直接靶基因,同時(shí)通過功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證TIMP3是否影響miR-373對(duì)ESCC細(xì)胞的遷移及侵襲作用。結(jié)果：1.轉(zhuǎn)染miR-373 mimics后, ECA109細(xì)胞中TIMP3蛋白的相對(duì)表達(dá)量要顯著低于陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor后,KYSE410細(xì)胞中TIMP3蛋白的相對(duì)表達(dá)量要顯著高于陰性對(duì)照組。2.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示,TIMP3-3'UTR-WT與miR-373 mimics共轉(zhuǎn)染到人HEK293T細(xì)胞中,其熒光值比陰性對(duì)照組下降37%,而TMP3-WT/NC, TIMP3-Mut/NC及TIMP3-Mut/miR-373之間沒有顯著差異。3.無3'-UTR區(qū)域的pcDNA3.1-TIMP3和miR-373 mimics共轉(zhuǎn)染到ECA109細(xì)胞中。pcDNA3.1-TIMP3能夠減弱miR-373 mimics對(duì)ECA109遷移及侵襲能力的促進(jìn)作用。shRNA-TIMP3與miR-373 inhibitor共轉(zhuǎn)染到KYSE410細(xì)胞中,shRNA-TMP3可以減弱niR-373 inhibitor對(duì)KYSE410遷移及侵襲能力的抑制作用。結(jié)論：在ESCC中,TIMP3為miR-373的直接靶基因,miR-373通過抑制TIMP3的表達(dá)來提高腫瘤的遷移及侵襲能力。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1
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本文編號(hào)：2307567