【摘要】：肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是一個全球公共健康難題,常規(guī)治療策略的效果不盡如人意。基因治療為肝癌尤其是進展期肝癌的治療帶來了一線曙光,截止目前共有17項肝細胞癌基因治療臨床試驗正在進行,有望成為肝癌的克星�；蛑委熭d體決定了治療基因表達的特異性和效率,對它的設計和構建是基因治療的關鍵因素和研究難點�；蛑委熭d體要保護治療基因免遭核酸酶破壞,并能夠特異性識別和進入靶細胞,之后還要面臨復雜的細胞內環(huán)境,完成“逃離內吞體”、避免“溶酶體降解”、定位到細胞核并啟動治療基因表達等一系列極具挑戰(zhàn)的任務。近年來,人工設計仿生載體(Designer biomimetic vector, DBV)作為基因治療載體備受矚目。一個高效的仿生載體包括核酸濃縮基序(DNA condensing motif, DCM)、靶向肽段(Targeted peptide,TP)、內吞體裂解基序(Endosome disrupting motif, EDM)、核定位信號(Nuclear localization signal, NLS)等基本要素。DBV通過DCM與治療基因自組裝成納米尺寸的顆粒,防止血清中核酸酶對治療基因的降解；TP的靶向作用可以經(jīng)受體介導的內吞途徑將基因治療載體攜帶至靶細胞內；而EDM能夠破壞內吞體膜將基因治療載體從內吞體釋放至胞漿中,并通過NLS的核定位作用將其定位至胞核實現(xiàn)治療基因的高效表達。本人所在的課題組既往的研究證實來源于瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(Circumsporozoite protein, CSP)的CSR2a肽段是一個新的理想的肝特異性靶向配體分子,對構建高效的肝癌基因治療靶向遞送系統(tǒng)具有較高的研究價值。另外,我們前期通過分析、鑒定獲得了一種新型腫瘤特異性啟動子-FZD7(Frizzled-7)啟動子,研究證實其具有突出的肝癌特異性和轉錄調控活性。目的在本研究中,我們以CSR2a作為特異配體設計、構建及評價了一種新型肝靶向納米多肽遞送系統(tǒng),為進一步實現(xiàn)FZD7啟動子調控下的肝癌精準治療奠定基礎。方法1.設計并利用基因工程重組技術制備基于CSR2a小肽的肝靶向遞送DBV。用免疫印跡實驗驗證His-tag;采用紅細胞溶血和組織蛋白酶D酶切位點鑒定實驗,檢測DBV pH依賴的內吞體胞膜裂解功能及靶向配體分子的釋放效應。2.將DBV與質粒pEGFP-N1進行混合,對影響包裹率的緩沖液、孵育溫度及孵育時間等因素進行分析；利用瓊脂糖凝膠電泳、Zeta電位儀、Nanosight納米顆粒分析儀和透射電子顯微鏡等對所形成納米顆粒的粒徑、負載電荷、pH穩(wěn)定性、中和效應等表征進行分析。3.通過血清穩(wěn)定性實驗、靶向肽段抑制試驗和細胞毒性實驗分析納米粒子DBV/pEGFP-N1的抗核酸酶降解能力、肝靶向性、細胞毒性等性能；最后,采用體外細胞實驗、動物體內實驗驗證DBV的肝靶向遞送功能。結果1.成功制得8種較高純度的DBV,其中只有DBV3的靶向肽段可被切除,被用于后續(xù)實驗；pH 7.4時DBV3不會使紅細胞裂解,而pH 5.5時發(fā)生裂解,證實了DBV3在酸性條件下具有胞膜裂解能力。2.室溫或者37℃條件下,在pH 5.5的醋酸鹽緩沖液中N/P(氮磷比)為10時,孵育1h更利于納米顆粒的自組裝,包裹率達到(99.1±0.7)%,所形成的DBV3/pEGFP-N1球形納米粒子水合粒徑為132±3.1 nm,負載電荷為+28.5+1.3 mV。3. DBV3/pEGFP-N1納米粒子中的pEGFP-N1質粒不會被血清中的核酸酶降解；靶向肽CSR2a與細胞孵育后,可以競爭性抑制DBV3/pEGFP-N1的肝靶向性能；DBV3/pEGFP-N1對細胞沒有明顯的毒性效應,且可以靶向進入正常肝細胞和肝癌細胞；硫酸長春新堿可以抑制DBV3/pEGFP-N1向核運輸；體內遞送實驗中,正常肝組織中有明顯熒光,而心、腎、脾、胃等組織中并未有熒光蛋白表達。結論本研究成功構建了一種以CSR2a小肽作為特異性肝靶向配體的新型肝靶向納米多肽遞送系統(tǒng),包含了DCM、EDM、NLS和CSR2a等功能元件,能夠在體外與DNA質粒自組裝成穩(wěn)定的納米粒子,保護DNA質粒不被血清核酸酶降解,與靶向肝細胞特異性結合,通過內吞作用進入細胞,能從溶酶體中釋放入細胞質,并在NLS的引導下定位到細胞核,成功表達了目的基因。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2301129