【摘要】：目的:曲妥珠單抗(赫賽汀#174;)是一種對HER2陽性乳腺癌十分有效的治療方法,而耐藥成為阻礙其應(yīng)用的難點(diǎn)。自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞是先天免疫的重要組成部分,并且是曲妥珠單抗誘導(dǎo)ADCC效應(yīng)最有效的細(xì)胞。為了增強(qiáng)對曲妥珠單抗耐藥乳腺癌的殺傷作用,本實(shí)驗(yàn)將曲妥珠單抗與NK細(xì)胞聯(lián)合來殺傷耐藥的乳腺癌細(xì)胞,同時(shí)檢測相互作用的機(jī)制。方法:1.用MTT法驗(yàn)證耐藥細(xì)胞的耐藥性,同時(shí)驗(yàn)證曲妥珠單抗對NK細(xì)胞無增殖抑制作用。2.鈣黃綠素-AM釋放法檢測NK細(xì)胞聯(lián)合曲妥珠單抗對敏感及耐藥乳腺癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用,同時(shí)對比阻斷Fas受體前后,兩者聯(lián)合殺傷的變化情況。3.流式細(xì)胞術(shù)分別檢測敏感及耐藥腫瘤細(xì)胞表面HER2的表達(dá)變化情況;分別檢測了不同處理組NK細(xì)胞表面活化性受體NKp44、NKp46、NKG2D,抑制性受體KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1,凋亡配體Fas L的表達(dá)變化;NK細(xì)胞內(nèi)部穿孔素及顆粒酶B的生成量;腫瘤細(xì)胞表面活化性配體ULBP1、ULBP2、MICA及凋亡受體Fas的表達(dá)情況;NK細(xì)胞在各實(shí)驗(yàn)組分泌至上清中的CCL5、IL13。4.ELISA法用于檢測NK細(xì)胞在各實(shí)驗(yàn)組分泌至上清的IFN-α及TNF-β的生成量的變化情況。結(jié)果:1曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞的耐藥性持續(xù)存在,耐藥細(xì)胞表面HER2表達(dá)量明顯降低。2曲妥珠單抗與NK細(xì)胞對耐藥細(xì)胞單獨(dú)殺傷作用均不明顯,但聯(lián)合后對耐藥細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng),且聯(lián)合殺傷率隨效靶比的增加而增加。進(jìn)一步研究兩者聯(lián)合作用機(jī)制發(fā)現(xiàn):曲妥珠單抗與NK細(xì)胞聯(lián)合作用于腫瘤細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞表面的活化性配體ULBP1、ULBP2、MICA、NK細(xì)胞表面活化性受體NKp44的表達(dá)量顯著增加,抑制性受體KIR2DL1,KIR2DL2,KIR2DL3及KIR3DL1的表達(dá)量明顯降低;共培養(yǎng)環(huán)境中NK細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-β、CCL5、IL13均明顯增加;NK細(xì)胞相關(guān)的凋亡受配體Fas及Fas L的表達(dá)被顯著上調(diào),阻斷Fas受體后,聯(lián)合殺傷作用明顯減弱,協(xié)同作用減弱甚至消失;NK細(xì)胞內(nèi)部穿孔素及顆粒酶由于其基礎(chǔ)表達(dá)量極高,故生成量沒有顯著變化。結(jié)論:1.SKBR3-pool2、BT474-HR20表面的HER2表達(dá)量降低可能是其耐藥的原因之一。2.HER2表達(dá)量降低不影響曲妥珠單抗介導(dǎo)NK細(xì)胞的ADCC效應(yīng),同時(shí)隨著NK細(xì)胞效靶比的增加,協(xié)同作用增強(qiáng)。3.在腫瘤細(xì)胞的環(huán)境中,曲妥珠單抗能夠通過以下幾個(gè)方面影響NK細(xì)胞:1增加NK細(xì)胞活化性受體、活化性配體,并降低NK細(xì)胞抑制性受體的表達(dá)量來增加NK細(xì)胞的活性;2增加NK細(xì)胞的細(xì)胞因子增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力;3增加NK細(xì)胞凋亡受配體Fas及Fas L的表達(dá)增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力。
[Abstract]:Objective: trotozumab (Herceptin 174;) is an effective treatment for HER2 positive breast cancer, and drug resistance has become a difficulty in its application. Natural killer (natural killer,NK) cells are important components of innate immunity and are the most effective cells to induce ADCC effect by tratozumab. In order to enhance the killing effect of tratuzumab on drug-resistant breast cancer, we combined tratozumab with NK cells to kill the drug-resistant breast cancer cells, and to examine the mechanism of interaction. Methods: 1. The drug resistance of drug resistant cells was verified by MTT assay, and the inhibitory effect of trotozumab on the proliferation of NK cells was also tested. 2. 2. The synergistic killing effects of NK cells combined with tritozumab on sensitive and drug-resistant breast cancer cells were detected by calcitonin AM release assay. The changes of the combined killing of NK cells before and after blocking Fas receptor were compared. 3. The expression of HER2 on sensitive and drug-resistant tumor cells was detected by flow cytometry. The expression of activated receptor NKp44,NKp46,NKG2D, inhibitory receptor KIR2DL1,KIR2DL2,KIR2DL3,KIR3DL1, apoptotic ligand Fas L on the surface of NK cells and the amount of perforin and granzyme B in NK cells were detected. Expression of activated ligand ULBP1,ULBP2,MICA and apoptotic receptor Fas on the surface of tumor cells; The changes of IFN- 偽 and TNF- 尾 production of NK cells secreted from the supernatant of NK cells in each experimental group were detected by CCL5,IL13.4.ELISA method in the secreted supernatant of each experimental group. Results: (1) the drug resistance of the drug resistant cells was persistent, and the expression of HER2 on the surface of the resistant cells was significantly decreased. 2 the cytotoxic effects of tratuzumab and NK on the drug resistant cells were not obvious. However, the cytotoxicity of drug resistant cells was significantly increased after the combination, and the combined killing rate increased with the increase of the effective / target ratio. It was found that the expression of activated receptor NKp44 on the surface of activated ligand ULBP1,ULBP2,MICA,NK cells on tumor cells increased significantly after the combined action of tratuzumab and NK cells. The expression of KIR2DL1,KIR2DL2,KIR2DL3 and KIR3DL1 decreased significantly. IFN- 緯, TNF- 尾 and CCL5,IL13 increased significantly in co-cultured environment. The expression of Fas and Fas L, the apoptosis-associated ligand of NK cells, was upregulated significantly. After blocking the Fas receptor, the combined killing effect was obviously weakened, and the synergism was weakened or even disappeared. There was no significant change in perforin and granzyme in NK cells due to their high basal expression. Conclusion: 1. The decrease of HER2 expression on SKBR3-pool2BT474-HR20 may be one of the reasons for its drug resistance. The decrease of 2.HER2 expression does not affect the ADCC effect of NK cells mediated by tritozumab, and with the increase of NK cell response to target ratio. Synergistic enhancement. 3. In the environment of tumor cells, trotozumab can affect NK cells in the following ways: (1) increase the activity of NK cells by increasing the activated receptors, activating ligands and decreasing the expression of inhibitory receptors in NK cells; (2) increase the cytokines of NK cells to enhance the killing ability of NK cells, and increase the expression of Fas and Fas L in the apoptotic ligands of NK cells and enhance the killing ability of NK cells.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2301343